摘要：背景和目的原发性肝细胞癌发病率高,且较早发生转移,预后较差。研究原发性肝细胞癌转移的机制具有较高的基...背景和目的原发性肝细胞癌发病率高,且较早发生转移,预后较差。研究原发性肝细胞癌转移的机制具有较高的基础和临床意义。既往研究表明,血管紧张素II(AngiotensinⅡ,AngⅡ)可以促进乳腺癌和胃癌的转移,但在肝癌中研究不多。高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)在肿瘤中的作用在近年来多有被关注。本课题旨在明确AngⅡ对肝癌细胞侵袭、迁移及上皮间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的促进作用,明确高迁移率族蛋白 B1(high mobility group protein B1,HMGB1)是否可以调控AngⅡ对肝癌细胞侵袭和迁移的作用。最后,筛选出可能影响HMGB1启动子的转录因子,验证AngⅡ刺激下,该转录因子可以使得HMGB1启动子的表达增加。方法1.培养HEPG2,SMMC7721,Huh7细胞,使用AngⅡ刺激细胞,分别用transwell实验检测细胞侵袭能力,划痕试验检测细胞迁移能力,使用westernblot检测EMT相关蛋白e-钙黏蛋白(ecadherin)和波形蛋白(vimentin)的变化,以明确AngⅡ对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的促进作用。2.分别构建HMGB1过表达载体和HMGB1-siRNA转染肝癌细胞,再次进行迁移、划痕和EMT相关蛋白的检测试验,以明确HMGB1对AngⅡ刺激下肝癌细胞迁移和侵袭和EMT的影响。3.使用双基因报告系统检测HMGB1启动子活性,筛查转录因子,分别通过qPCR,WB和ChIP实验确认转录因子和HMGB1启动子之间的关系。结果1.细胞划痕和trans-well结果显示肝癌细胞HepG2、SMMC7721和Huh-7加入AngⅡ后,细胞侵袭性和迁移能力显著增高(P<0.05);western blot结果显示经AngⅡ处理的肝癌细胞(HepG2、Huh-7、SMMC-7721)中HMGB1表达均上调(p<0.05)2.验证HMGB1在AngⅡ诱导肝癌细胞EMT过程中的作用,首先western blot结果显示与配对癌旁组织相比,HMGB1在人肝癌组织中表达明显上调(p<0.05)。然后将成功构建的HMGB1稳定过表达和HMGB1表达抑制的肝癌细胞做细胞划痕、trans-well和western blot验证EMT过程相关蛋白的变化,结果显示与三种正常肝癌细胞相比,经AngⅡ处理后的肝癌细胞侵袭和迁移能力增强,e钙黏蛋白(ecadherin)表达下调,波形蛋白(vimentin)表达上调;与阴性对照(NC)相比,HMGB1高表达的三种肝癌细胞经处理后,侵袭和迁移能力增强,ecadherin蛋白表达下调,vimentin表达上调;而经HMGB1干扰的三种肝癌细胞经AngⅡ处理前后,侵袭和迁移能力无明显差异,ecadherin和vimentin表达无明显差异。3.对HMGB1相关转录因子进行预测分析发现有19个转录因子可能发生改变,然后通过荧光定量PCR,WB实验发现,经AngⅡ处理后三种肝癌细胞(HepG2、Huh-7、SMMC-7721)中转录因子E4F1表达均升高,ChIP实验验证了AngⅡ刺激下,E4F1与HMGB1启动子结合增强。结论肝癌细胞系中转录因子E4F1被AngⅡ激活后在HMGB1启动子区转录结合促进HMGB1表达,AngⅡ通过诱导HMGB1表达增强肝癌细胞的侵袭和迁移能力,能够促进肝癌细胞EMT过程。更多还原显示全部
