摘要：背景晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)堆积是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)皮肤...背景晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs)堆积是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)皮肤并发症的重要原因。丙酮醛(Methyglyoxal,MGO)是一种活性二羰基化合物,是AGEs产生的重要中间体,在糖尿病的病理过程中能生成AGEs。N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-cysteine,NAC)是某些临床常用药的主要活性成分,参与内源性还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)和硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)的生成。然而,NAC可否通过抑制AGEs的产生或其毒性,减轻DM诱导的皮肤损伤仍鲜有报道。因而,本研究旨在观察NAC对MGO诱导的糖尿病性皮肤细胞损伤的影响及分子机制。方法应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测糖尿病患者和健康志愿者血浆中AGEs的含量。用牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)与MGO于37℃孵育3 d制备AGEs。根据AGEs具有自发荧光和形成棕色溶液的特点,分别用荧光酶标仪检测340/465 nm反应体系中荧光强度以及观察BSA与MGO混合溶液的颜色;进一步观察NAC对MGO诱导的AGEs生成的影响。人永生化角质形成细胞(Human adult low calcuim kertinocytes,Ha Ca T)给予MGO处理,模拟糖尿病血液或组织中高MGO状态,建立糖尿病皮肤伤口愈合障碍的体外模型。从细胞活力、线粒体膜电位、细胞的粘附和迁移功能、炎症因子的分泌、核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)亚基p65的核转位、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达以及细胞外基质的含量进行评价。在MGO处理Ha Ca T细胞前,用NAC预处理1 h,观察NAC对MGO诱导的上述指标改变的影响,以明确其皮肤细胞保护效应。最后,通过检测AGEs的受体(receptor for advanced end products,RAGE)的表达,以及其中和抗体(Neutralizing antibody against RAGE,N-ABR)预处理对MGO诱导的Ha Ca T细胞损伤的影响,最终揭示MGO诱导的细胞损伤以及NAC的细胞保护效应是否依赖于RAGE的激活。结果1.糖尿病患者血浆中AGEs的含量高于正常人,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.MGO和BSA反应后,溶液颜色加深,荧光增强,提示MGO可诱导AGEs的生成。NAC处理可以降低溶液的颜色和荧光强度(P<0.01),提示其可以抑制MGO诱导的AGEs生成。另外,用MGO处理Ha Ca T细胞,可使细胞培养基中AGEs含量增加,NAC预处理能明显抑制MGO诱导的AGEs生成,差异具有统计学意义(P<0.01)。3.用MGO处理Ha Ca T细胞,可以剂量依赖性地降低细胞活力、损害线粒体膜电位和细胞的粘附和迁移等行为学功能,这种损害效应可以被NAC预处理所减弱。提示NAC可减弱MGO诱导细胞损伤。4.Ha Ca T细胞经MGO处理后,炎症因子IL-6和IL-8的分泌增加、NF-κB亚基p65核转位增强,NAC预处理能抑制MGO诱导的炎症因子分泌和NF-κB亚基p65核转位。提示NAC能抑制MGO诱导的炎症反应。5.MGO处理Ha Ca T细胞可导致MMP-9的表达上调以及I型胶原的生成减少,这种效应能部分被NAC预处理逆转。提示NAC改善MGO诱导的细胞迁移障碍可能与改善细胞外基质的水平有关。6.MGO处理可上调Ha Ca T细胞内RAGE受体的表达,NAC预处理可以抑制MGO诱导的RAGE受体过表达。重要的是,用RAGE中和抗体阻碍其作用后,MGO引起的细胞受损,炎症因子释放,MMP-9过度表达以及NF-κB亚基p65核转位均被部分改善。提示MGO诱导的皮肤细胞炎症损伤与RAGE受体的激活有关,而NAC拮抗MGO的损伤作用是通过抑制RAGE受体实现的。结论本文研究证实,NAC可减弱MGO诱导的皮肤细胞损伤,其机制与抑制AGEs的生成和AGEs/RAGE/NF-κB信号通路的活化有关。本文的研究为临床应用NAC相关的药物防治糖尿病皮肤并发症提供了基础资料与理论支持。更多还原显示全部
