摘要：目的:生物碱是一类含氮有机化合物,其包含许多天然产物（如喜树碱、麻黄碱、乌头碱、士的宁）和合成药物（...目的:生物碱是一类含氮有机化合物,其包含许多天然产物（如喜树碱、麻黄碱、乌头碱、士的宁）和合成药物（如普鲁卡因、三氟拉嗪、阿米替林）。生物碱具有广泛的药理活性,如抗病毒、抗菌、抗癌、抗炎及抗抑郁活性。N-葡萄糖醛酸化代谢（NG代谢）是多种叔胺生物碱在人体内重要的代谢途径,可极大地影响叔胺生物碱在体内的浓度,从而改变其药效/毒性。然而,叔胺生物碱的NG代谢行为和规律尚不明确,其影响因素仍需阐明。本论文研究将评价葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）在叔胺生物碱NG代谢中的作用,阐明外排转运体和核受体对NG代谢的调控效应及作用机制。具体研究目标如下:（1）建立NG代谢的体外评价体系,测定叔胺生物碱的NG代谢活性;（2）评价UGT1A4和UGT2B10在叔胺生物碱NG代谢中的作用,考察NG代谢的种属间差异;（3）明晰外排转运体对NG代谢产物的外排作用,考察其对NG代谢的调控效应;（4）明确调控NG代谢的关键核受体,阐明调控机制。方法:1. 采用UGT1A4和UGT2B10特异性底物（三氟拉嗪、可替宁和阿米替林）建立NG代谢的体外代谢体系。考察缓冲盐种类、p H值、打孔剂、Mg Cl2浓度、UDPGA浓度和β-葡萄糖醛酸苷水解酶抑制剂对NG代谢的影响,优化体外代谢条件。在优化条件下测定叔胺生物碱的NG代谢活性,采用液相-质谱联用法对生成的N-葡萄糖醛酸苷进行鉴定。此外,采用UGT1A4和UGT2B10重组酶测定两者对叔胺生物碱的代谢活性。2.对六种生物碱（米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪、士的宁和马钱子碱）的NG代谢进行全面表征,包括单酶筛选、动力学测定、活性相关性分析、代谢抑制实验和种属代谢差异分析。明晰UGT1A4和UGT2B10对生物碱NG代谢的贡献程度。3.采用慢病毒转染法构建UGT2B10高表达HEK293细胞（简称为HEK2B10细胞）。通过q PCR法、蛋白免疫印迹分析和活性检测对该细胞模型的UGT2B10表达及活性进行测定。测定三种生物碱（阿米替林、米安色林和苯甲嗪）在HEK2B10细胞中的代谢和代谢物外排。通过化学抑制法（MK571和Ko143）和生物抑制法（sh RNA）,明确外排转运体（BCRP和MRP4）对NG代谢的调控效应。4.采用q PCR法测定代谢酶调控核受体在Hep G2细胞中的表达。考察核受体激动剂对细胞中UGT2B10表达和活性的影响,明确调控UGT2B10的关键核受体。结合启动子报告基因分析、凝胶迁移分析和染色质免疫共沉淀分析等分子生物学技术阐明关键核受体对UGT2B10的调控机制。结果:1. 建立了NG代谢体外评价体系根据特异性底物最大代谢速率原则,我们建立了NG代谢体外评价体系。该体系含:100 m M Tris-HCl缓冲液（p H 7.4）,4 m M Mg Cl2,20μg/m L alamethicin,及8 m M UDPGA。采用该反应体系,我们准确测定了三氟拉嗪（UGT1A4特异性底物）、可替宁（UGT2B10特异性底物）和阿米替林在个体肝微粒体中的代谢活性。阿米替林（5和100μM）的代谢速率与可替宁（2 m M）的代谢速率显著相关（r>0.8,p<0.001）,而与三氟拉嗪（40μM）的代谢速率相关性差。该结果说明低浓度的阿米替林可作为UGT2B10特异性底物,用于肝微粒体UGT2B10活性的表征。2.UGT1A4和UGT2B10催化多种生物碱的NG代谢我们发现了17种可发生NG代谢的生物碱,包括阿塞那平、洛沙平、氯氮平、氯丙嗪、度硫平、多塞平、米氮平、米安色林、氯苯甲嗪、苯甲嗪、异丙嗪、环苯扎林、伊马替尼、倒千里光碱、士的宁、曲唑酮和马钱子碱。重组酶代谢结果表明,曲唑酮不被UGT1A4和UGT2B10代谢,倒千里光碱和马钱子碱只被UGT1A4代谢,其余生物碱均可被UGT1A4和UGT2B10代谢。3.UGT2B10为催化叔胺生物碱NG代谢的主要代谢酶UGT2B10主要代谢五种生物碱（米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪和士的宁）,其不代谢马钱子碱。与UGT1A4相比,UGT2B10介导的生物碱NG代谢具有更低的Km值,说明UGT2B10与生物碱分子间有更强的结合力。提示UGT2B10可能在体内NG代谢中发挥更为重要的作用。4.叔胺生物碱的NG代谢存在显著的种属间差异生物碱（三氟拉嗪、可替宁、阿米替林、米氮平、米安色林、苯甲嗪、氯苯甲嗪、士的宁和马钱子碱）在人和动物（猴子、小鼠、大鼠、兔子、狗和豚鼠）肝脏中的NG代谢存在显著差异。这些生物碱在大鼠和小鼠中几乎不发生NG代谢。该结果说明常规动物不适合作为人体NG代谢研究模型。5.外排转运体（BCRP和MRP4）可调控NG代谢我们成功构建了UGT2B10高表达HEK293细胞（HEK2B10细胞）。三种生物碱（阿米替林、米安色林和苯甲嗪）在该细胞模型中均可被代谢生成相应的N-葡萄糖醛酸苷（代谢物）。抑制外排转运体（BCRP和MRP4）功能或降低其表达可显著降低代谢物的外排,增加代谢物在细胞内的蓄积,表明BCRP和MRP4介导N-葡萄糖醛酸苷的外排转运。BCRP和MRP4抑制导致N-葡萄糖醛酸苷的总生成率减少,N-葡萄糖苷的总生成率增加。表明UGT2B10介导的NG代谢具有外排转运体依赖性（即所谓的“外排转运体-UGT代谢酶相互作用”）。同时,N-葡萄糖化代谢可作为NG代谢的补偿途径。6.胆酸核受体FXR调控UGT2B10表达在Hep G2细胞中,FXR激动剂（CDCA和GW4064）诱导UGT2B10的m RNA表达,并增强了细胞对阿米替林（UGT2B10特异性底物）的代谢活性。启动子报告基因、EMSA和CHIP结果表明FXR通过与UGT2B10近端启动子上的IR1结合位点（-209-197 bp）结合并激活UGT2B10的转录活性。同时,所发现的IR1位点是控制UGT2B10启动子转录活性的关键元件。因此,FXR是调控UGT2B10表达的关键核受体,其可能是影响UGT2B10在个体间表达差异的一个因素。结论:1. 本研究发现NG代谢是多种叔胺生物碱存在的代谢途径,加深了对生物碱代谢通路的认识与理解。2.本研究发现NG代谢具有显著的种属间差异,将有力指导模式动物的合理选择。3.本研究发现UGT1A4和UGT2B10是催化叔胺生物碱NG代谢的主要代谢酶,且UGT2B10在人体NG代谢中可能扮演着更为重要的角色,为UGT2B10的功能研究提供科学依据。4.本研究发现外排转运体（BCRP和MRP4）和核受体（FXR）均可调控NG代谢,揭示了体内NG代谢的复杂性。更多还原显示全部
