摘要：目的:根据Th17细胞在自身免疫性疾病发展中所起的作用和金黄葡萄球菌肠毒素A对T细胞作用的相关研究,研究金...目的:根据Th17细胞在自身免疫性疾病发展中所起的作用和金黄葡萄球菌肠毒素A对T细胞作用的相关研究,研究金黄葡萄球菌肠毒素超抗原SEA诱导外周血Th17细胞分化的机制,为RA等自身免疫性疾病发病机制的研究提供实验依据。方法:1.酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞因子IL-17A、IL-1β、TGF-β1、IL-6、IL-23和IL-21的分泌水平。2.实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测外周血单个核细胞(PBMC)中STAT3和RORγt m RNA的表达水平。3.免疫印迹(Western blotting)检测外周血单个核细胞(PBMC)中STAT3和RORγt蛋白的表达水平。4.流式(flow cytometry,FCM)分析外周血单个核细胞(PBMC)中Th17细胞分化的百分比。结果:1.用不同浓度SEA(0、5、10、50、100、500ng/ml)作用于正常人PBMC,细胞因子IL-17A、IL-1β和IL-23的分泌随SEA的浓度增加而增多(P<0.05);而IL-6和TGF-β1的分泌与SEA没有明显的量效关系(P>0.05),IL-21分泌量低于检测灵敏度。2.用500ng/ml SEA刺激不同时间(0、6、12、24、48、72h),PBMC分泌的细胞因子IL-17A、IL-1β、和IL-23随时间增加而分泌增多(P<0.05);在SEA作用的初期IL-6分泌增加、然后分泌有所减少,但仍维持在较高水平;TGF-β1与SEA没有时效关系(P>0.05)。3.SEA组、Anti-CD3/C D28组和LPS组细胞因子L-17A、IL-1β和IL-23的分泌与正常组有明显差异(P<0.05),三组之间IL-17A、IL-1β和IL-23的表达都有差异(P<0.05);SEA组和Anti-CD3/CD28组IL-17A、IL-1β和IL-23的分泌水平较LPS组高(P<0.05);SEA组TGF-β1的分泌比LPS组增多(P<0.05),但其他组之间TGF-β1的分泌没有差异(P>0.05)。各组之间IL-6的分泌水平没有差异(P>0.05)。4.SEA组、Anti-CD3/CD28组和LPS组STAT3 m RNA和RORγt m RNA与正常对照组比较表达增加(P<0.05)。SEA组、Anti-CD3/CD28组中STAT3 m RNA和RORγt m RNA表达比LPS组增加(P<0.05)。5.SEA组、Anti-CD3/CD28组和LPS组的STAT3和RORγt蛋白与正常对照组比较表达增加(P<0.05),SEA组与Anti-CD3/CD28组的STAT3和RORγt蛋白表达比LPS组增加(P<0.05),且SEA组与Anti-CD3/CD28组之间的STAT3和RORγt蛋白表达没有差异(P>0.05)。6.与加入相同浓度的伊马替尼(IM)后的SEA组、Anti-CD3/C D28组和LPS组比较,SEA组、Anti-CD3/CD28组STAT3和RORγt蛋白的表达被抑制(P<0.05);Anti-CD3/C D28组STAT3蛋白的表达量与阴性对照组比较没有差异(P>0.05),而SEA组和LPS组的STAT3蛋白表达与阴性对照组比较仍略有增加(P<0.05);SEA组、Anti-CD3/CD28组RORγt蛋白的表达与阴性对照组比较没有差异(P>0.05),而LPS组RORγt蛋白的表达与其他组比较表达增加(P<0.05)。7.流式分析SEA组、Anti-CD3/CD28组和LPS组PBMC中Th17细胞的百分比,其均比正常对照组增高(P<0.05);其中SEA组和Anti-CD3/CD28组Th17细胞分化的百分比与LPS组比较有明显差异(P<0.05),Anti-CD3/CD28 m Ab诱导Th17细胞分化的百分比最高。结论:1.SEA可以刺激正常人PBMC分泌细胞因子IL-17A、IL-1β和IL-23;2.IM抑制SEA诱导的Th17细胞分化;3.SEA可能通过TCR途径促进STAT3和RORγt基因、蛋白的表达;4.SEA可能主要以超抗原的方式通过TCR途径诱导Th17细胞的分化。更多还原显示全部
