摘要：目的:神经网络的建立需神经突起的生长发育提供物质基础,而神经突起的生长发育主要通过改变细胞骨架的运动...目的:神经网络的建立需神经突起的生长发育提供物质基础,而神经突起的生长发育主要通过改变细胞骨架的运动进行调控,细胞骨架的运动主要依靠微管与微丝间的不断聚合和解聚,而微管与微丝间的互作机制仍未完全阐明。微管切割蛋白Spastin与微管结合蛋白CRMP5均参与神经突起生长过程,前期我们已证实Spastin与C RMP5能相互结合并明确相互结合位点,本研究的主要目的在于进一步明确Spastin协同CRMP5如何介导细胞骨架的运动,调控神经突起的生长发育。材料与方法:首先通过免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下观察Spastin与CRMP5在Hela细胞和神经元中共定位的情况;在Hela细胞中过表达SpastinM87V及各截短片并结合共聚焦显微镜观察微管的切割情况;培养原代神经元,并利用磷酸钙转染方法导入SpastinM87V及各截短片,观察神经元突起的变化情况;进一步我们设计针对Spastin相对特异的干扰小片段si-Spastin导入神经元中并观察对其突起的影响情况;将SpastinM87V及各截短片导入神经元中并记录m EPSC的变化情况;同样,在原代神经元中转染CRMP5观察神经元突起的变化情况;我们进一步在Hela细胞中共转染SpastinM87V和CRMP5,观察微管切割的变化;同时,在神经元中共转染SpastinM87V和CRMP5,观察神经元突起的变化情况;通过设计不同的分组将质粒导入神经元中,分别观察同时沉默Spastin与CRMP5以及沉默Spastin而过表达CRMP5或沉默CRMP5而过表达Spastin不同处理对神经元突起的影响情况;在神经元中进一步共转染SpastinM87V和CRMP5,观察m EPSC的变化情况。结果:1)免疫细胞化学结果示:Spastin与CRMP5共存于Hela细胞的胞质,神经元的胞质和突起中。2)培养Hela细胞并过表达SpastinM87V、Spastin N190、Spastin△AAA、Spastin△N1、Spastin△N2基因:SpastinM87V和Spastin△N1基因能将Hela细胞微管切割成小片段。3)培养原代海马神经元并过表达SpastinM87V、Spastin N190、Spastin△AAA、Spastin△N1、Spastin△N2:SpastinM87V、Spastin△N1、Spastin△N2可以明显促进海马神经元轴突、树突侧枝的形成和突起生长。4)将GFP、SpastinM87V、Spastin N190、Spastin△AAA、Spastin△N1、Spastin△N2导入神经元中,用全细胞膜片钳检测结果示:SpastinM87V、Spastin△N1、Spastin△N2组神经元的m EPSC的频率和幅度均较GFP+m C herry组增大。5)设计Spastin si-RNA干扰片段,与SpastinM87V共导入293T细胞中,western-blot检测其干扰效果明显,导入神经元,观察到干扰Spastin对神经突起的生长有抑制作用。6)在原代海马神经元过表达CRMP5、CRMP5N471、CRMP5△471结果示:CRMP5、CRMP5△471可以明显促进海马神经元轴突、树突侧枝的形成和突起生长。7)在Hela细胞共转染GFP和m Cherry、SpastinM87V和CRMP5、SpastinM87V和m C herry、GFP和CRMP5结果示:导入CRMP5不影响SpastinM87V对Hela细胞微管的切割效率。8)在原代海马神经元共过表达GFP和Mecherry、SpastinM87V和CRMP5、SpastinM87V和m Cherry、GFP和CRMP5结果示:SpastinM87V和CRMP5组促进海马神经元轴突、树突侧枝的形成和突起生长更加明显。9)在神经元中分别导入NC、si-Spastin、si-CRMP5、si-Spastin+si-CRMP5、si-Spastin+C RMP5、Spastin+si-CRMP5结果示:干扰Spastin或C RMP5均抑制神经元突起的生长,同时干扰两者则抑制神经元突起生长更明显,若干扰Spastin或CRMP5,同时过表达Spastin或CRMP5则能部分抵消抑制突起生长作用。10)将GFP+m C herry、SpastinM87V+CRMP5、SpastinM87V+m C herry和CRMP5+GFP导入神经元,用全细胞膜片钳检测结果示:SpastinM87V+CRMP5、SpastinM87V+m C herry、CRMP5+GFP组的m EPSC的频率和幅度均较GFP+m C herry组增大。结论:1)Spastin与C RMP5在体内存在相互共定位。2)SpastinM87V对Hela细胞的微管的切割作用需有完整的微管结合区（MTBD区）和AAA ATP催化区（AAA区）。3)过表达CRMP5不影响SpastinM87V对Hela细胞微管的切割效率。4)SpastinM87V对神经元突起生长及分支形成的促进作用与MTBD及AAA功能域密切相关。5)CRMP5对神经元突起生长及分支形成促进作用的主要功能域在472-564氨基酸间。6)SpastinM87V与CRMP5能协同调控神经元突起生长及分支的形成。更多还原显示全部
