摘要：虽然雨生红球藻虾青素的生物合成途径已经探明,但由于研究背景不清晰、调控网络复杂等原因,至今还不清楚虾...虽然雨生红球藻虾青素的生物合成途径已经探明,但由于研究背景不清晰、调控网络复杂等原因,至今还不清楚虾青素合成调控的的分子机制。随着高通量测序技术的普及,小RNA、转录组等组学技术越来越成熟,多组学联合分析成为研究复杂的基因调控网络所必需的重要手段。本研究从miRNA的角度切入,通过对胁迫初期的雨生红球藻192.80进行小RNA测序,获得雨生红球藻已知miRNA和新miRNA的序列信息,通过靶基因预测和富集分析发现可能参与调控虾青素合成的miRNA。通过胁迫初期小RNA测序数据与mRNA转录组数据的联合分析,获得表达量负相关的mi RNA-靶基因对,通过qRT-PCR实验验证miRNA及其靶基因的表达趋势。另外,通过数据库比对获得转录组中的转录因子基因,并分析转录因子与mRNA之间的调控关系,从而构建转录因子调控网络。最后,通过组学间的联合分析对雨生红球藻虾青素合成的miRNA-TF共调控网络进行研究。具体研究内容及结果如下:（1）通过对强光和醋酸钠胁迫初期的雨生红球藻进行小RNA高通量测序,总共获得9,363,208 clean tags,小RNA长度在21bp处出现峰值。总共鉴定出276个已知的miRNA,分别属于259个家族。此外,根据miRNA可能的前体预测并获得300个新的miRNA;（2）获得19个差异表达的miRNA,其中14个上调表达,5个下调表达。表达模式分析结果显示下调表达的mi RNA表达模式相同,而上调的miRNA则存在不同的表达模式。通过对靶基因的预测和富集,共获得2122个靶基因,并对其进行GO注释和KEGG富集,同时发现hp-miR167-5p和hp-miRm0034等miRNA与类胡萝卜素和油脂的合成相关;（3）通过mRNA-miRNA组学关联分析获得6组表达量负相关的miRNA-靶基因对,显示miRNA可能参与了雨生红球藻早期胁迫的响应过程并发挥功能;（4）本研究探讨了两种雨生红球藻小RNA的提取方法,结果表明:RNAiso for Small RNA（TAKARA）和百泰克公司的microRNA快速提取试剂盒都可以用于雨生红球藻小RNA的提取,RNAiso for Small RNA（TAKARA）的提取效率更优。为了获得可用于荧光定量PCR的稳定内参,通过筛选稳定的小RNA、荧光定量PCR验证和多因素比较等手段获得可用于雨生红球藻miRNA qRT-PCR的稳定内参M-3。然后,通过qRT-PCR验证了5组表达量负相关的miRNA-靶基因对表达趋势,显示miRNA与靶基因之间存在负相关的表达趋势;（5）对强光和醋酸钠联合胁迫的雨生红球藻基因转录进行分析,结果显示有13个虾青素合成途径关键酶基因在胁迫1.5h和胁迫3h表达量很高,包括PDS,ZDS,LCY,BKT和crtR-B,如crtR-B（ChGLEAN10006000）在胁迫1.5h表达量提高24倍。11个虾青素合成途径关键酶基因在胁迫24h和48h时表达量很高,包括IPI、GGPS、PSY、BKT、CRTZ,如BKT（XLOC038901）在胁迫24h表达量提高了19.6倍,CRTZ（ChGLEAN10005232）在胁迫24h提高了16.07倍。TAG合成途径关键酶基因在胁迫各个时间点均有表达,其中,2个G3PDH酶基因、4个GPAT基因、9个DGAT基因在胁迫24h和48h表达量相对较高,说明雨生红球藻TAG在24和48h的合成更活跃;（6）通过数据库比对获得了332个转录因子,分别属于27个转录因子家族。利用转录组数据构建了转录因子调控网络图。分析结果显示有5个转录因子家族参与虾青素合成的调控,调控的基因主要包括类胡萝卜素氧化酶/酮化酶等。同时,还发现有3个转录因子家族参与油脂合成的调控,调控的基因主要包括甘油二酯酰基转移酶等;（7）通过小RNA转录组数据和mRNA转录组数据的联合分析对雨生红球藻虾青素合成的miRNA-TF共调控网络进行研究。结果显示4个miRNA和9个转录因子参与了雨生红球藻胁迫后虾青素和油脂合成的调控。雨生红球藻虾青素和油脂合成途径的酶基因既受转录因子的正调控,也受miRNA的负调控,这两个途径既有各自的转录因子和miRNA,还共享一些miRNA和转录因子,显示雨生红球藻虾青素合成与油脂合成存在紧密联系。综上所述,雨生红球藻细胞中存在miRNA并在响应环境胁迫时发挥一定的调控作用。同时,通过miRNA-TF共调控网络发现miRNA和转录因子同时参与了雨生红球藻虾青素及油脂合成的调控,mi RNA对酶基因起负调控作用,转录因子对酶基因起正调控作用,通过对酶基因转录水平的调控来发挥作用,包括miRNA-mRNA的调控模块和TF-mRNA的调控模块,一些共同的miRNA和转录因子可能有助于转录水平的同步调控,最终在转录水平对虾青素合成进行调控。因此,本研究为解析雨生红球藻虾青素合成调控机制奠定了基础。更多还原显示全部
