摘要：背景与目的:A型核纤层蛋白(lamin A)是参与DNA复制、DNA损伤修复、基因表达、转录调控、端粒动力学和维持染...背景与目的:A型核纤层蛋白(lamin A)是参与DNA复制、DNA损伤修复、基因表达、转录调控、端粒动力学和维持染色质结构的多功能重要蛋白质。其磷酸化修饰是它在细胞核内运动迁移,参与调节多种蛋白功能和启动细胞周期核膜溶解的重要基础。然而目前对于lamin A的磷酸化功能调控知之甚少,并且lamin A上大多数磷酸化位点的功能重要性仍未有报道。目前已知LMNA基因G608G突变导致lamin A C-端缺失50个氨基酸,形成异常lamin A(progerin)在核内堆积并引发细胞衰老。以往研究多关注于progerin对细胞毒性和胞核形态改变,而我们发现progerin缺失的50个氨基酸中存在多个磷酸化位点,质谱分析发现有些位点属于高转化率位点,提示它们发挥重要功能。我们研究的目的在于寻找这段lamin A C-末端缺失的关键磷酸化位点及其特异的磷酸激酶,探讨位点磷酸化对于laminA核内定位及细胞衰老通路的影响。方法:我们首先通过生物信息学方法筛选lamin A缺失肽段高转换的磷酸化位点,通过构建位点突变质粒进行293T细胞转染,免疫沉淀分析lamin A特异位点磷酸化水平,发现关键位点的突变显著影响lamin A的整体磷酸化。然后我们制备了关键位点的磷酸化抗体,通过免疫共沉淀及体内外激酶实验,证实磷酸化关键位点的激酶。此外,我们通过慢病毒表达系统构建lamin A突变体细胞,并进行免疫荧光实验、MTS实验、β-gal染色实验等,检测磷酸化位点失活对lamin A核内分布及细胞衰老的影响。结果:(1)本研究鉴定了lamin A的两个重要磷酸化位点Ser628及Ser636,发现Ser628和Ser636位点的突变降低了laminA蛋白的整体磷酸化水平。(2)我们证实了糖原合酶激酶3β(GSK3β)与lamin A存在相互作用并磷酸化lamin A Ser628位点。(3)同时发现酪蛋白激酶II(CK2)磷酸化lamin A Ser636位点,并通过此位点的激活参与调控GSK3β对lamin A的磷酸化作用。(4)我们通过慢病毒感染构建Ser628和Ser636点突变细胞,发现位点磷酸化失活影响lamin A核内分布。(5)Ser628、Ser636位点失活影响细胞增殖并且导致细胞衰老。(6)诱导损伤后,点突变细胞DNA损伤应答明显降低。结论:我们的研究结果证明GSK3β及CK2共同介导lamin A C-末端Ser628、Ser636位点磷酸化的激活,这两个位点的磷酸化缺失影响lamin A核内分布并导致细胞衰老。这些结果提示lamin A C-末端位点磷酸化参与细胞衰老通路的调控,通过小分子药物提高或改善其磷酸化水平有可能为延缓细胞衰老提供新的治疗思路。更多还原显示全部
