摘要：目前,在世界各地,溺水死亡是仅次于交通事故的第二大非正常死亡原因,其中多数溺水死亡为意外造成,但也有个...目前,在世界各地,溺水死亡是仅次于交通事故的第二大非正常死亡原因,其中多数溺水死亡为意外造成,但也有个别为自杀或他杀案件,因此,科学和准确地对水中尸体的死因进行法医学鉴定,对于解决案事件,缓解社会冲击与消除社会影响,具有积极意义。但是,溺死诊断还存在取材工具较为粗放易于污染,诊断技术过于单一和评价方法较少等影响诊断稳定性的的问题,亟需通过科学研究加以解决。本研究整合电路设计,机械制作,现代分子生物DNA技术与扫描电镜观察等系列技术,着重从溺死诊断取材工具、检验方法到结果评价等多个方面进行科学实用溺死诊断技术的研究,旨在尝试发明更为适用于快速准确诊断溺死的骨骼取样工具和提供更为科学准确的诊断溺死的分子生物学方法。一、以机械夹具及电动控制相关部件的构思,借助立式机械钻床的工作原理,设计制作了一种骨骼前处理的专业设备,共包含4个功能模块:1、供电电源,提供4路工作电路回路,分别对照明、紫外消毒、上下运动的钻头电机、水平移动的夹具电机进行控制;2、样品取样腔,以金属机械夹具,步进电机,可拆卸钻头配合形成取样工具替代手工取样;3、样品收集腔,大于30°的收集漏斗和连续切换的档位机构配合组成,支持样本的连续收集;4、整体采用304不锈钢材料,加上大于50千克的承重单元,确保设备运行中的稳定。选取了检案积累的尸体白骨20例,作为取样工具研究的材料。设备与手工取样所得的样本对DNA检验结果无显著影响(p>0.05)。设备取样过程未检测到发生污染现象。而对照的手工取样过程则检测到3例样本疑被污染。本设备取样过程耗时仅约为是手工取样的1/2。在一次检验成功率上,手工取样与设备取样则无显著性差异。分别使用骨骼设备和手工取样法对溺死尸体骨骼取样,结果表明检测到的硅藻种类和数量没有显著性差异,尸体的骨髓含有溺死相关硅藻,能满足溺死诊断要求。二、以建立溺死诊断的PCR-CE技术为主要目标,设计和筛选获得高特异性和灵敏度的引物,在筛选与溺死过程可能涉及的生物物种的标准株基础上,构建PCR-CE检测方法对溺死尸体进行初步验证,以便为后续的复合扩增检测体系奠定研究基础。1.通过Primer premier 5.0软件,Oligo7.0软件对引物进行设计和评价,PAGE方法验证,成功地筛选得到高特异性、强灵敏度和可靠稳定的3对引物(rbcL197,UPA159,A457),3对引物分别针对硅藻的rbcL基因,UPA基因,18SrDNA基因,具有特异性。以16种藻类标准株、3种水生细菌、3种人体共生细菌和人的DNA进行特异性实验,研究结果表明,rbcL197和UPA159同为叶绿体上的基因片段,对针杆藻、直链藻、舟形藻、菱形藻、小环藻、脆杆藻均具有特异性;A457可对多个种类的藻类具有特异性,如念珠藻、针杆藻、舟形藻、直链藻、蛋白核小球藻、普通小球藻、斜生栅藻、镰形纤维藻、小环藻、菱形藻、脆杆藻等。扩增产物长度分别为197bp,159bp,655bp。应用引物PCR-CE建立的方法对案件检材样本(30例溺死尸体,3例陆地死亡空白,2例死后入水)进行初步研究和应用验证,引物rbcL197、UPA159和A457构建的PCR-CE方法的总检测阳性率分别为85.9%,83.7%,52.8%。引物rbcL197和UPA159所构建的PCR-CE检验方法的检出率及阳性率均比引物A457高,而利用引物rbcL197和UPA159建立的PCR-CE检验方法,两者对溺死尸体各种脏器及水样中藻类DNA检验阳性率,无统计学差异(p>0.05)。2.通过Primer premier 5.0软件和Oligo7.0软件对引物设计和评价,PAGE方法验证,成功地筛选得到高特异性、强灵敏度和可靠稳定的4对引物(AH,Ah,AHH,AER),分别针对嗜水气单胞菌的gyrB基因、16SrDNA基因、hly基因、aer基因,具有特异性。以16种藻类标准株、1种水生细菌、1种人体共生细菌和人的DNA进行特异性实验,仅嗜水气单胞菌显示有阳性PCR结果,扩增产物长度分别为195bp,350bp,127bp,175bp。应用这4对引物建立PCR-CE检测方法,对案件检材样本(36例溺死尸体,4例陆地死亡空白,1例死后入水)进行初步研究和应用验证,引物AH,Ah,AHH,AER构建的PCR-CE方法的总检测阳性率分别为86.1%、52.8%、83.3%、44.4%。比较引物AH,AHH构建的检验体系的检验阳性率,两者间无统计学差异(p>0.05)。三、比较目时诊断溺死的硅藻形态学检验的主要分离富集方法,以确认形态学分离富集的最佳选择。并使用该方法对建立的PCR-CE检测技术进行比较评价。1.通过60例溺死的实验兔,比较目前法医实验室3种主要应用的硅藻检验方法:(A)强酸微波消化-尼龙膜抽滤-电镜检测法,(B)强酸微波消化-PES膜抽滤-电镜检测法,(C)强酸消化-离心富集-电镜检测法(传统的强酸消化离心富集方式),结果证明:(A)方法在硅藻的总回收率(76.9±20.2%)和回收过程对硅藻的破坏率(0.9±1.1%),及酸液耐受性上等多个方面指标为最优;(B)方法的硅藻总回收率与(A)没有显著性差异,在抗酸耐久能力上不如(A),但PES膜可透明化,可应用于成本较低的光镜检验,更有推广的可行性。2.以(A)方法,评价构建的浮游藻类和浮游细菌(嗜水气生单胞菌)DNA的PCR-CE检测方法。浮游藻类DNA的引物UPA159和rbcL197构建的PCR-CE检测方法(总阳性率分别为85.9%,83.7%)和MD-VF-AutoSEM法诊断溺死的阳性率(总阳性率为97.2%)之间无统计学差异,而引物A457则具有统计学差异。利用引物AH和AHH建立的PCR-CE检测方法,对嗜水气生单胞菌进行检测,总阳性率分别为86.1%,83.3%。和MD-VF-Auto SEM方法检测硅藻的总阳性率为97.2%比较,两者对诊断溺死的阳性率之间无统计学差异,而引物Ah和AER(52.8%,44.4%)的方法则具存在统计学差异。更多还原显示全部
