摘要：目的:巨噬细胞是机体抗感染最重要的固有免疫细胞之一,也是联系固有免疫和适应性免疫的纽带。巨噬细胞通过...目的:巨噬细胞是机体抗感染最重要的固有免疫细胞之一,也是联系固有免疫和适应性免疫的纽带。巨噬细胞通过其细胞表面或内部的特异性识别受体(PRR),识别病原相关分子模式(PAMP),从而启动炎症反应,并上调炎症小体组成成分(如NLRP3、pro-caspase-1和pro-IL-1β等)的表达;如果巨噬细胞在损伤相关分子模式(DAMP)信号(即危险信号分子)的进一步刺激下,上述炎症小体成分可组装成具有活性的炎症小体,释放成熟的caspase-1和IL-1β等,或诱导细胞程序性死亡(焦亡)。细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的重要组分之一,位于其细胞壁的外壁层。在人体免疫系统对抗细菌入侵时,LPS作为PAMP被巨噬细胞的PRR所识别,而ATP是由细菌或宿主细胞在细菌感染或组织损伤的情况下释放的危险信号分子,LPS激活的细胞在ATP的进一步刺激下,诱导炎症小体活化,进而诱导细胞焦亡。以前有研究发现,ATP处理可以导致腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活化。AMPK是细胞能量代谢的感受器。然而,AMPK信号通路是否参与以及如何参与ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡的调控,目前尚不明确。本研究以LPS活化的巨噬细胞为模型,包括小鼠巨噬细胞系J774A.1、巯基乙酸盐(thioglycollate,TG)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞和小鼠骨髓体外培养诱导的巨噬细胞(BMDM),探讨胞外ATP诱导炎症小体活化和细胞焦亡与AMPK信号通路的关系。本项目还将探讨AMPK信号通路调控对细菌感染的小鼠脓毒症模型生存率的影响,验证该信号通路对炎症小体活化和细胞焦亡的调控作用机制。方法:LPS处理巨噬细胞,可上调炎症小体相关组分(包括NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β)的表达;在ATP的进一步作用下,NLRP3招募凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing a CARD,ASC)(ASC因此聚集成speck),共同组装成有活性的炎症小体,激活caspase-1,并将pro-IL-1β剪切加工,细胞发生焦亡,释放成熟的IL-1β和HMGB1。因此,本论文利用多种方法检测LPS+ATP激活炎症小体和细胞焦亡,以及AMPK信号对上述炎症小体和细胞焦亡的调控作用:由于发生焦亡的细胞其细胞膜上形成众多孔隙,使细胞膜失去完整性,故采用碘化丙锭(PI)染色法检测细胞焦亡;免疫印迹法检测细胞胞内及上清中IL-1β、HMGB1和caspase-1的表达水平,指示炎症小体激活和细胞焦亡的发生;免疫荧光技术检测巨噬细胞P2X7嘌呤能受体(P2X7R)以及ASC的亚细胞分布及荧光强度;CBA试剂盒(内含结合相应抗体的免疫微球)结合流式细胞术检测细胞培养上清或实验动物血清中的IL-1β表达水平;流式细胞术检测二甲双胍对小鼠腹腔中中性粒细胞比例的影响;利用二甲双胍作为AMPK激动剂,或compound C作为AMPK抑制剂,或siRNA敲低AMPKα1的表达,并利用上述各检测方法,检测AMPK信号通路对炎症小体和细胞焦亡的调控作用;利用E.coli细菌腹腔感染C57BL/6小鼠,构建脓毒症模型,检测二甲双胍灌胃对脓毒症小鼠炎症小体活化和动物生存率的影响。结果:细胞焦亡检测实验发现,单独二甲双胍不会导致LPS激活细胞发生焦亡,但二甲双胍呈剂量依赖性促进LPS+ATP诱导的细胞焦亡;而compound C可以抑制ATP诱导的细胞焦亡以及二甲双胍对细胞焦亡的促进作用;免疫印迹法显示,在蛋白水平上,单独LPS(或LPS+二甲双胍)刺激不能诱导细胞释放成熟IL-1β、活化的caspase-1p10片段和HMGB1到细胞外;但当加入ATP刺激后,AMPK信号通路被激活,伴随着炎症小体的活化和细胞焦亡,即释放成熟IL-1β、活化caspase-1和HMGB1到胞外;而二甲双胍可以剂量依赖性地促进上述细胞释放成熟IL-1β、活化caspase-1和HMGB1的水平,且AMPK抑制剂compound C和AMPKα1的敲低显著抑制ATP诱导的炎症小体活化和细胞焦亡;免疫荧光检测发现,LPS活化的BMDM细胞经ATP刺激后,细胞内原本均匀分布的ASC聚集成斑点状,且二甲双胍可以显著地促进ASC聚集,而compound C可以抑制二甲双胍的促进作用;同时在TG诱导产生的、经LPS活化的小鼠腹腔巨噬细胞中发现,二甲双胍能够显著的促进ATP受体(P2X7R)在细胞膜上的分布水平;动物模型实验也表明,二甲双胍可显著促进脓毒症小鼠的死亡率,提示二甲双胍通过激活AMPK信号途径,加重细菌感染导致的急性炎症(包括炎症小体活化和细胞焦亡)。结论:尽管巨噬细胞内AMPK活性在LPS作用下受到抑制,但ATP处理可通过显著激活AMPK,激活炎症小体,诱导细胞焦亡。该研究结果提示,可通过调控AMPK信号通路治疗与炎症小体活化有关的炎症性疾病。更多还原显示全部
