摘要：背景:成肌分化过程包括成肌细胞的增殖,然后分化为成肌细胞,最后融合形成肌管。小鼠C2C12细胞是常用的研究...背景:成肌分化过程包括成肌细胞的增殖,然后分化为成肌细胞,最后融合形成肌管。小鼠C2C12细胞是常用的研究成肌分化的细胞模型。microRNA(miRNA)是一类通过靶向靶基因mRNA的3′UTR,抑制其翻译或诱导其降解,在转录后水平调控基因表达的微小非编码RNA。已有研究表明,miRNA在成肌分化中起重要调控作用。最近,本研究鉴定了39个新的与成肌分化相关的miRNA,其中包括miR-34b。miR-34b是miR-34家族成员(包括miR-34a、miR-34b和miR-34c)之一,已有文献表明miR-34参与和促进多种细胞的分化,但其在成肌分化中的功能尚不清楚。目的:探究miR-34b在成肌分化过程中的功能及其调控机制。方法与结果:利用本实验室建立的S-Poly(T)Plus miRNA检测技术,发现miR-34b在成肌分化和肌肉损伤后再生过程中表达上调。在C2C12细胞中转染化学合成的miRNA类似物或抑制剂,发现miR-34b具有抑制成肌细胞增殖并促进成肌分化的功能。为探讨miR-34b调控成肌细胞增殖分化的分子机制,本研究利用isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)技术,在蛋白质水平定量分析了受miR-34b调控的基因,并构建了成肌细胞受miR-34b调控的网络图。在过表达miR-34b后下调的97个蛋白中,Ywhag、Ahcy和Ncl为miR-34b潜在的靶基因(生物信息学预测),并通过了3′UTR荧光素酶报告载体的验证。其中,NUCL蛋白的表达趋势与细胞分化状态密切相关。通过免疫染色和Western Blot检测,发现NUCL的表达和细胞内定位在成肌分化过程中呈现动态变化。利用慢病毒介导的shRNA技术感染C2C12细胞,发现干扰Ncl表达后能明显抑制成肌细胞增殖和成肌分化。为进一步验证Ncl在成肌分化中的作用,在C2C12细胞转染了多种靶向Ncl的siRNA,分析了nucleolin表达水平与myogenin之间的关系;结果表明,Ncl既可能促进肌肉分化,也可能抑制肌肉分化,具体功能依赖于Ncl的蛋白表达水平。另外,本研究还发现miR-34b在成肌分化过程中的显著上调受甲基化调控。结论:miR-34b在成肌过程中上调,抑制细胞增殖并促进成肌分化,该调控作用通过靶向一系列基因(包括Ywhag、Ahcy和Ncl)而实现。miR-34b-Ncl轴在成肌分化调控过程中扮演重要功能。Ncl以剂量依赖性的方式调节成肌分化,而miR-34b正是以微调的方式调控Ncl在成肌分化过程中的表达水平。更多还原显示全部
