摘要：背景和目的:氨基甲酸酯类抑制剂作为治疗药物在临床上应用非常广泛,含有氨基甲酸酯基团的药物分子可作为胆...背景和目的:氨基甲酸酯类抑制剂作为治疗药物在临床上应用非常广泛,含有氨基甲酸酯基团的药物分子可作为胆碱酯酶（Cholinesterases,ChEs）和其他丝氨酸水解酶的伪-底物抑制剂。应用的实例之一,班布特罗,一种用于治疗哮喘的特布他林前体药物,可特异性抑制丁酰胆碱酯酶（Butyrylcholinesterase,BChE）。当氨基甲酸酯类药物与丝氨酸水解酶作用时,酶的活性位点会发生氨基甲酰化,酶失去活性,而氨基甲酸酯类药物被水解。与酶结合的氨基甲酰基团水解非常缓慢,因此酶会在相对较长的一段时间内失活。传统方法是通过监测不同水相介质或组织中氨基甲酸酯及其醇羟基产物的浓度变化来研究氨基甲酸酯类抑制剂的水解稳定性,包括UPLC/MS-MS（Ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry）或者基于HPLC（High performance liquid chromatography）分离串联离线辐射检测法等一些方法。这些方法样品处理困难,且成本昂贵,对设备及实验室条件要求较高,在某种程度上限制了这些方法的使用。因此需推导出一种简单易行,成本较低,且准确性和精确度合理的方法,对氨基甲酸酯类药物的特异性代谢进行定量评估。虽然有多种方法可用于鉴定参与药物代谢的最主要的酶和组织,但在药物具有多个代谢位点和多种代谢途径情况下,难以确定体内实际的主要代谢位点和途径。本论文中描述的定量方法可用于特异性分析涉及ChEs的氨基甲酸酯类药物的代谢途径,从而简化对主要代谢途径的鉴定过程,并有助于表征这类药物的ADME（Absorption,Distribution,Metabolism,Excretion）特性。研究内容:1)在本论文中,我们研究了胆碱酯酶与氨基甲酸酯抑制剂之间的反应,该反应广义上属于机制性酶抑制（Mechanism-based enzyme inactivation）,推导出了胆碱酯酶水解的氨基甲酸酯类抑制剂的量与被氨基甲酰化的酶浓度-时间曲线下面积（The area under the concentration of the carbamylated enzyme-time curve,AUIC）之间的数学关系。该方程能用于计算在一定时间窗内被胆碱酯酶特异性代谢的氨基甲酸酯抑制剂的量。同时该方程在抑制剂浓度已知的情况下还可求得反应中总的酶浓度。为将本方法应用至体内代谢研究,我们考虑了在体内条件下酶有半衰期,推导出包含该参数的校正方程可用于计算半衰期对AUIC法的影响。2)为证明该关系的可行性,我们选择人血浆丁酰胆碱酯酶（BChE）和左旋-班布特罗单氨基甲酸酯（R-bambuterol monocarbamate,R-MONO）作为模型酶和氨基甲酸酯类抑制剂的代表。通过将不同浓度的酶与不同浓度的氨基甲酸酯抑制剂孵育直至完全水解,获得氨基甲酰化酶的浓度-时间曲线数据。通过酶活性测定获得总的酶浓度和去氨基化速率常数（k3）（Decarbamylation rate constant,k3）。3)通过这些数据得到的AUIC可用于计算被水解的R-MONO的浓度。并将计算得到的理论值与实际值进行比较,以得到该方法的准确性:相对偏差（Relative error,RE%）<15%及精确度:相对标准偏差（Relative standard deviation,RSD%）≤23%。可见精确度及准确性都在合理范围内,因此本方法能提供一种可靠估算被胆碱酯酶水解的氨基甲酸酯类药物的新手段。同时用该方法估算的胆碱酯酶总的酶浓度也与实际值相吻合。4)在本文中尝试将AUIC法应用至对其他研究中药物代谢信息的挖掘,选取了美普他酚氨基甲酸酯衍生物及卡巴拉汀的抑制-时间曲线数据,在美普他酚氨基甲酸酯衍生物的代谢研究中的应用体现了这种AUIC方法用于体外研究的潜力。而AUIC法分析的口服给药和贴剂给药后,卡巴拉汀在人血液和脑脊液中的药代动力学数据,为该药的代谢过程提供了新的见解,并显示了该AUIC法用于体内研究的潜力。结论:本文基于对AUIC的分析建立了一种简单的方法来估计由ChEs代谢的氨基甲酸酯药物的量。在应用本方法时,仅需获取酶的总摩尔浓度和去氨基甲酰化速率常数,而这些参数都可以通过实验方便地测量。该方法除了简单之外,主要优点是它不需要关于氨基甲酰化动力学信息,因此它可以应用于缺乏这种信息的实验（如体内代谢研究）。该方法可用于从体内代谢研究中获得的数据中挖掘酶-特异性和组织-特异性的代谢信息,从而促进氨基甲酸酯类抑制剂的代谢表征研究工作,并有助于更好地理解这类药物的ADME性质。将该方法适当完善后,可以扩展到任何遵循相同作用机制的酶-抑制剂体系的研究中去。更多还原显示全部
