导　　师： 韩双艳;蒋为民

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 干扰素(Interferon,IFN)是动物细胞在受到某些病毒感染后,分泌的具有抗病毒功能的宿主特异性蛋白。几乎所有的动物在病毒、细菌、支原体等刺激感染后,细胞都会生产I型干扰素,其中I型干扰素的IFNα在病毒感染细胞与相应的受体结合激活JAK-SATA联级放大系统,与IRTS结合引起PKR,OAS等蛋白表达,抑制病毒的复制。因而,IFNα的基因工程表达和纯化生产对人和畜牧养殖动物的抗病毒感染具有重要的意义,有望作为畜禽疾病治疗的新手段之一。在本研究中,考虑到原核和真核的密码子有显著不同,因而根据大肠杆菌密码子偏好性,对重组猪α干扰素(po IFNα)的cDNA首先做了密码子优化,使其更适合在大肠杆菌中表达。密码子优化的poIFNαcDNA委托公司合成,装载到pUC57克隆载体。实验中,进一步通过NdeI和Xho I位点双酶切和体外连接,将poIFNα基因序列成功亚克隆到大肠杆菌胞内表达载体pET-22b(+)中。基因工程菌经摇瓶培养,采用IPTG诱导表达后,发酵菌体经细胞破碎后,证明重组蛋白rPoIFNα以包涵体的形式存在,分子量约为19.1kDa,imageJ软件分析选取表达量高的菌株最为发酵菌种保存。进一步将发酵放大,建立了30L发酵罐培养。通过发酵条件优化,诱导表达4小时后,每升发酵液能获得80.15g湿菌体,大规模高效生产重组蛋白rPoIFNα发酵工艺的初步确立。发酵工程菌破碎后,重组猪α干扰素包涵体通过不同浓度的Triton X-100和尿素洗涤实验和不同pH值的包涵体裂解液溶解实验,建立了一条用含有4M尿素的洗涤液洗涤重组猪α干扰素包涵体,pH10.0并且含有100 mM巯基乙醇的8M尿素溶解包涵体的预处理工艺路线。进行了两种复性方法和两种氧化还原体系对于重组猪α干扰素复性效果的比较。结合成本控制要求,将重组猪α干扰素的工艺确定为以L-胱氨酸和L-半胱氨酸为氧化还原体系,快速稀释法复性重组猪

关 键 词： 猪干扰素 大肠杆菌 发酵 包涵体 纯化

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