导　　师： 刘志刚

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 深圳大学

摘　　要： 养蚕在中国已有5000年历史,养蚕业在中国规模庞大,参与人员众多,家蚕的广泛养殖以及随之而来的蚕丝用品的大量使用导致家蚕过敏时有发生。家蚕过敏临床表现以过敏性哮喘为主,伴有过敏性鼻炎、结膜炎和过敏性皮炎。本研究结合蛋白组学和免疫学方法首次发现家蚕新过敏原HSP70蛋白,利用分子生物学方法成功克隆表达出重组HSP70蛋白,重组HSP70蛋白与家蚕过敏患者血清具有很强的免疫原性,并用其成功致敏小鼠建立了哮喘模型进一步验证了其免疫原性,最后通过细胞实验初步探讨了其致敏机理,这为家蚕引发的过敏的特异性治疗和诊断奠定了良好的基础。目的(1)通过蛋白组学和Western blotting(WB)的方法筛选出家蚕潜在的过敏蛋白并进行质谱鉴定。(2)获取过敏原HSP70的全基因序列,构建表达载体,诱导表达获得大量重组HSP70蛋白并进行免疫学鉴定。(3)通过HSP70重组蛋白建立小鼠过敏性哮喘模型,评价其免疫原性。(4)通过细胞实验初步探讨家蚕HSP70致敏机制。方法(1)从广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所获取实验所用的家蚕,提取家蚕总蛋白,进行2-D分离蛋白,再将蛋白转印到PVDF膜上,封闭后将膜与家蚕过敏患者血清进行共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人Ig E抗体反应寻找其中的阳性斑点;取其中的7号斑点切胶酶解后,进行MALDI-TOF-MS分析,通过与家蚕肽指纹图谱进行比对鉴定该斑点;(2)合成HSP70蛋白基因并将其构建到pet-28a表达载体上,重组质粒转化至E.coli BL21,IPTG诱导基因表达,通过NI-NAT亲和层析获取高纯度蛋白;对重组蛋白进行过敏原性鉴定,包括WB实验、ELISA实验。(3)选用30只6-8周龄的BALB/c小鼠,饲养在SPF动物房,随机分为3组:粉尘螨粗提液组(HDM组)、HSP70重组蛋白组(HSP70组)和生理盐水对照组(control组)。HDM组用100μg尘螨粗浸液加4 mg氢氧化铝佐剂皮下

关 键 词： 家蚕 蛋白 过敏原 哮喘模型

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