导　　师： 刘冬梅

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质,会对人体造成急性和慢性危害,因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常必要。本课题组在前期研究中从豆瓣酱中筛选并鉴定出一株能高效降解亚硝酸盐的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LJ01,本研究获得了该菌株中编码亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NiR)的全长基因序列后,对其进行生物信息学分析,还构建基因工程菌和探究了重组NiR的酶学部分性质,具体为:B.cereus LJ01中编码NiR的基因(nir)由1623个碱基对组成,在GenBank数据库的登录号为MG839504。生物信息学分析工具分析显示,该NiR蛋白是由540个氨基酸残基数组成,分子量约为60 ku,等电点pI为5.47;是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白,且可能属于Fd-NiR中的NiRA。将B.cereus LJ01中nir基因被克隆至不同的表达载体上,分别构建了重组菌pET-28a(+)-nir-BL21和pET-32a(+)-nir-BL21。对于同一重组菌,在诱导温度为16℃时NiR表达量最高,25℃时次之,35℃时最少;在同一诱导温度下,NiR在pET-28a(+)-nir-BL21中的表达水平明显优于在pET-32a(+)-nir-BL21中的;因此选择pET-28a(+)-nir-BL21作为基因工程菌来开展后续的研究工作。从培养基成分对工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的生物量形成进行初步优化,获得了最佳培养基成分条件为:以液体LB培养基为基础培养基,再添加葡萄糖5 g·L和细菌学蛋白胨15 g·L。最后,确定最佳诱导条件为:IPTG浓度0.2 mM、诱导温度13℃、诱导时间20 h,在此条件下NiR的可溶性蛋白表达量最优。粗酶液经Ni-NTA柱亲和层析进行初步纯化,依次用25 mM、50 mM、75 mM、250mM和500 mM咪唑缓冲液洗脱,确定用250 mM咪唑的洗脱组分中重组NiR含量最高,75 mM的次之,500 mM咪唑的洗脱组分几乎不含蛋白;对于同一洗脱组分,在加入细胞色素C后,酶比活力变化不大,说明重组NiR自身具有降解NaNO的能力,反应过程中不需

关 键 词： 蜡样芽孢杆菌 亚硝酸盐还原酶 克隆表达 分离纯化 酶学性质

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