导　　师： 刘宝华

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 深圳大学

摘　　要： 目的:研究DNA损伤修复机制对昼夜节律的影响,ATM与Period2蛋白的相互作用以及ATM激酶活性对Period2蛋白功能的调节。方法:1.同步化后,运用Western Blotting检测永生化MEF细胞和HEK293细胞胞内ATM蛋白水平是否震荡;2.利用CRISPR-Cas9系统构建ATM KO细胞株,并通过RT-PCR检测ATM基因敲除对MEF细胞和HEK293细胞生物钟核心基因转录表达和节律性的影响;3.通过跑轮实验检测ATM基因缺失对小鼠昼夜节律的影响;4.利用Western Blotting检测ATM蛋白缺失细胞和小鼠组织中核心生物钟元件在蛋白质水平的改变;5.通过CHX-chase分析方法检测ATM缺失细胞中外源性PER2蛋白和内源性PER2蛋白的降解速率;6.采用免疫共沉淀方法检测ATM和PER2蛋白的相互作用;7.在ATM缺失的HEK293细胞中免疫纯化Myc-PER2蛋白,运用Western Blotting检测其蛋白磷酸化差异,使用ATM激酶抑制剂和激活剂研究ATM激酶对PER2的磷酸化修饰以及蛋白稳定性的影响;8.运用高精度质谱技术,分析ATM蛋白缺失后PER2蛋白磷酸化水平的改变,找出ATM磷酸化PER2的精确氨基酸位点。结果:1.永生化MEF细胞和HEK293细胞同步化处理后,胞内ATM蛋白水平有显著震荡性;2.ATM基因敲除后,生物钟核心基因转录表达受到明显干扰;3.Atm+/-小鼠昼夜节律发生明显紊乱;4.ATM蛋白缺失后,不同细胞和小鼠组织中PER2蛋白水平显著下降;5.ATM基因敲除显著加速了HEK293细胞中PER2蛋白的降解;6.ATM蛋白和PER2蛋白相互作用;7.Western Blotting结果显示PER2蛋白的磷酸化水平在ATM KO HEK293细胞中降低,KU55933处理(抑制ATM活性)加速胞内PER2蛋白降解,CPT处理(激活ATM)维持了PER2蛋白的稳定性;8.ATM基因敲除后,胞内PER2蛋白的磷酸化修饰位点发生多处变化。结论:永生化MEF细胞和HEK293细胞中ATM蛋白水平具有显著震荡性;ATM磷酸化修饰PER2蛋白,维持其稳定性,进而调控生物钟核心反馈环。更多还原

关 键 词： 生物钟 损伤修复反应 磷酸化

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