导　　师： 刘云岗

学科专业： J0405

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 多氯联苯(PCBs)是一组持久性有机污染物,在2013年已被国际癌症研究组织(IARC)确认为第一类致癌物。尽管30多年前许多国家已经禁止PCBs的生产和销售,但因其化学稳定性和食物链富集作用而仍然存在于环境中。PCBs作为全球性污染物对人体健康构成危害,可引起内分泌紊乱、癌前病变、癌变、肝脏、生殖及免疫功能损害、生长发育障碍等,因此对PCBs毒性的研究很有必要。PCBs可分为共平面[二噁英类似,dioxin-like(DL)]和非共平面[非二噁英类似,non-dioxin-like(NDL)化合物,DL-PCBs可持续激活芳烃受体(AHR),从而引起各种病理变化[包括致癌作用和细胞色素P450第一家族(CYP1)酶蛋白诱导等];而NDL-PCBs则可被CYP2E1代谢活化为致突变物。DL-PCBs共包括12个化合物(例如PCB 77、PCB 81等);在数目更多的NDL-PCBs中,最受关注的是人体负荷较高的7个指示性PCBs(例如PCB 52、PCB 28、PCB 20等)。关于PCBs的致突变性(致癌作用的一个主要机制),目前认为主要涉及NDL-PCBs。我们最近发现人CYP2E1可活化多个二氯联苯化合物为致突变物;近期的试验结果提示三氯联苯化合物中PCB 22的CYP2E1依赖性致突变作用强于所有12个二氯联苯。因此本研究主要采用NDL-PCBs中的PCB 22和PCB 52(后者为指示性PCBs之一),观察其诱发哺乳动物细胞微核与基因突变作用,并探讨人CYP2E1、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP3A4对其代谢活化的贡献大小。目的1.验证重组表达不同生物转化酶的V79衍生细胞系中人CYP1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1酶的表达及其特征性代谢活化作用[V79-Mz细胞不具有 CYPs、UDP-glucuronosyl transferases(UGTs)或 sulfotransferases(SULTs)]。2.观察细胞内人 CYP 酶(1A1、1B1、1A2、3A4、2E1)对 PCB 22 和 PCB 52的代谢活化和相关致突变作用;比较不同CYP亚型对受试PCBs活化作用的差异。3.对一系列NDL-PCBs化合物(包括本团队已报道的二氯联苯化合物以及此次研究的三氯和四氯联苯化合物PCB 20、PCB 22、PCB 52)CYP2E1依赖性致突变强度排序,并分析其结构-毒性关系,以期为PCBs健康危险度评价提供参考。方法1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹(Western Blot)试验采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹(Western Blot)对重组V79衍生细胞所表达的酶蛋白进行鉴定(表达hCYP1A1、hCYP1B1、hCYP1A2、hCYP3A4、和hCYP2E1的细胞以及V79-Mz对照细胞)。2.CCK-8 试验系列浓度的 PCB 22、PCB 52、甲磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate,EMS)、N-二甲基亚硝胺(N-Nitrosodimethylamine,NDMA)、2-硝基丙烷(2-nitropropane,2-NP)、苯丙(a)芘(Benzo(a)pyrene,B(a)P)、黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)对V79-Mz和表达不同代谢酶的V79衍生细胞进行染毒。作为溶剂DMSO终浓度<2‰(v:v),每组设置6个重复样,染毒/恢复时程为12 h/12 h(对应于微核试验)或24 h/48 h(对应于致突变试验),按CCK-8试验标准程序操作,最后测定样品在450nm处光密度值。以细胞相对生长/存活率不低于60%为微核试验受试物浓度选择的原则。3.微核试验微核试验是检测染色体或者有丝分裂器损伤的一种遗传毒性实验方法。我们分别采用上述六个细胞系进行PCB 22和PCB 52(以及作为参照化合物的各CYP酶依赖性前致突变物)的微核实验,以及用V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞进行PCB 20的微核实验。采用12 h/12 h染毒/恢复时程,然后经消化、低渗、固定、滴片、染色步骤,最后在光学显微镜油镜下观察并记录随机出现的结构完整(无凋亡或坏死)细胞中含微核的细胞频率。每个样品共观察2000个细胞,并计算各组微核细胞率(均数±变异范围,n = 2)。4.Hprt致突变试验细胞在Hprt(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)位点的正向突变(即获得对6-巯基嘌呤的抗性)为观察终点。细胞接种24h后染毒1d,于4d和7d分别传代。第二次传代时接种细胞分别测试细胞在正常培养液中的集落形成率(n = 3)和对6-巯基嘌呤有抗性的突变子(n = 4)频率。7-10天后计算集落形成率和突变细胞率。5.统计学分析CCK-8的实验结果用均数±标准差表示,统计学分析采用AVOVA;Hprt致突变试验和微核实验结果以均数±变异范围表示,但在统计学处理前将重复测定值合并以转化为计数资料,分别采用Fisher确切概率法和卡方检验分析数据。结果1.免疫印迹实验未显示V79-Mz细胞表达任何CYP酶,而V79-hCYP1A1、V79-hCYP1B1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR、V79-CYP2E1-SULT1A1 分别表达 CYP 酶 1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1。2.以CCK-8试验观察EMS(直接致突变物)、NDMA、2-NP、B(a)P、AFB1(前致突变物)与PCB 22和PCB 52分别作用于V79-Mz和各相应V79衍生细胞系的细胞毒作用。各前致突变物对表达相应活化酶的细胞和V79-Mz对照细胞的作用未见明显差异。依据所获结果,选择细胞相对生长/存活水平不低于60%作为微核试验和Hprt致突变试验浓度设计的标准,即EMS:5mM;NDMA:100μM,300μM;2-NP:2mM,4mM;B(a)P:2μM,4μM,8μM;AFB1:0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.8μM。3.作为阳性对照EMS诱发V79-Mz细胞产生微核与基因突变,但前致突变物NDMA、2-NP、B(a)P和AFB1对V79-Mz均无明显作用。然而,NDMA和2-NP诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞基因突变,且呈浓度依赖性;B(a)P诱发V79-hCYP1A1与V79-hCYP1B1细胞基因突变和微核形成,均有明显浓度-效应关系;AFB1则对V79-hCYP1A2和V79-hCYP3A4-hOR细胞均诱发基因突变和微核形成,并显示浓度相关性。4.PCB22(2μM～6μM)、PCB52(10μM～40μM)和 PCB20(1 μM～4μM)诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞微核形成,且效应呈现浓度依赖性;而在表达其它CYPs的V79衍生细胞仅在最高受试浓度(40μM)呈现出具有统计学意义的微核细胞率(轻度)增高,或者未出现统计学差异。受试PCBs及各参照化合物对V79-Mz细胞微核试验结果均为阴性。5.PCB 22、PCB 52对V79-Mz细胞无致突变作用,而对V79-CYP2E1-SULT1A1细胞具有很强的致突变作用,并呈浓度-效应关系。二受试物在最高受试浓度均对V79-hCYP1B1细胞诱发轻度基因突变,在其余细胞系(V79-hCYP1A1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR)则未出现致突变作用。而 PCB 20对V79-Mz细胞无致突变作用,对V79-CYP2E1-SULT1A1细胞具有很强的致突变作用,并呈浓度-效应关系。结论1.重组 V79 衍生细胞系 V79-hCYP1A1、V79-hCYP1B1、V79-hCYP1A2、V79-hCYP3A4-hOR、V79-CYP2E1-SULT1A1 分别表达人类 CYP1A1、CYP1B1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2E1;前致突变物B(a)P、AFB1、NDMA、2-NP诱发相应微核与基因突变,而对V79-Mz无作用,说明细胞内所表达的重组酶蛋白具有相应的代谢活化作用。2.PCB 22 和 PCB 52 对表达五种人 CYP 酶(CYP1A1、1B1、1A2、3A4 和共同表达CYP2E1、SULT1A1)以及PCB 20作用于表达人CYP2E1的衍生细胞的微核试验与致突变试验结果的比较,提示CYP2E1酶可以活化PCBs为致突变物,而其它CYPs酶缺乏此作用或作用微弱。人CYP2E1可能是负责NDL-PCBs代谢活化及相关致突变作用的一个主要的代谢酶。3.可以考虑把PCBs的代谢依赖性致突变作用纳入相关PCBs健康危险度评估的观察终点。更多还原

关 键 词： V79衍生细胞 CYPs酶 蛋白质表达 PCBs(PCB 22/PCB 52/PCB 20) [31719]代谢活化 遗传毒性

分 类 号： [R114]

领　　域： []