导　　师： 管武太

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 本研究通过结合组合突变与分子模拟技术探究多对二硫键对解脂耶氏酵母脂肪酶2耐热性能的影响;并将脂肪酶突变体与分子伴侣PDI（Protein disulfide isomerase）、转录因子HAC1（The homologous to the activating transcript factor/cAMP-response e le me nt b ingd ing prote in）共表达于毕赤酵母，优化其表达水平。本研究旨在提高解脂耶氏酵母脂肪酶2在饲料工业的应用价值。本文分为四个试验：　　试验一：将本实验室前期筛选出的强耐热型二硫键突变位点（S8-214、S60-69、S191-241、S122-196和S118-177）进行迭代组合，探究多对二硫键对该脂肪酶耐热性能的影响。试验二：利用Br id geD多模板算法扩大采样范围，筛选更多的二硫键潜在突变位点，将新筛选的突变位点加入突变位点库;再通过将相同或不同区域的二硫键组合，探讨区域组合效应;然后在试验一的基础上对该脂肪酶进行迭代组合突变。试验三：利用分子动力学模拟，从微观角度研究多对二硫键对该脂肪酶耐热性能的影响。试验四：将脂肪酶突变体与分子伴侣PDI和转录因子HAC1共表达，以优化表达水平。　　试验结果如下：　　1、将突变位点S191-241与S8-214或S122-196进行组合，脂肪酶突变体不能正常表达或酶催化效率大幅度降低。突变位点S8-214、S60-69、S122-196和S118-177间的组合均不影响各自的成键。通过迭代组合突变，获得引入两对、三对和四对二硫键的脂肪酶突变体（2S：S214+69、S214+196、S214+177、S69+196、S69+177和S196+177;3S：S214+69+196、S214+69+177、S69+196+177和S214+196+177;4S：4s）。其中脂肪酶突变体4s的耐热性能大幅度提高，其Td（Dnaturation temperature）和T1550（Half lost temperaturefor15 min）值分别为64.77和68.35℃，比野生型（Native）分别提高16.45和27.49℃。　　2、利用BridgeD多模板算法，筛选出3个强二硫键脂肪酶耐热突变体S1-242、

关 键 词： 饲料工业 解脂耶氏酵母脂肪酶 突变体表达 二硫键 热稳定性

领　　域： []