导　　师： 王革非;覃青松

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 汕头大学

摘　　要： 目的：本课题组前期研究工作表明，ZWINT1基因存在新的选择性剪接亚型，命名为ZWINT-1isoformc(简称ZWINT-1v4)，并且发现ZWINT-1(ZWINT-1isoforma，简称ZWINT-1v1)及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4在食管癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织。为了探究ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4生物学功能及其作用机制的差异，以及在食管癌的发生和发展中可能存在的作用，本实验分别构建稳定表达ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的EC109细胞系，并在此基础之上，采用亲和纯化联合质谱分析的方法对可能与两者存在相互作用的蛋白进行差异性分析。　　方法：将本课题组前期已构建的重组真核表达质粒pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v1-6×His和pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v4-6×His进行再次测序确认后，分别转染EC109细胞，构建稳定表达细胞系。利用Westernblot检测融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4在转染细胞中的表达情况，采用免疫荧光技术检测重组真核表达质粒的瞬时转染效率。利用嘌呤霉素进行加压筛选，建立稳定表达融合蛋白ZWINT-1v1及融合蛋白ZWINT-1v4的EC109细胞系。通过亲和纯化技术分离与目的蛋白ZWINT-1v1和ZWINT-1v4相互作用的蛋白复合体，并进行质谱检测和生物信息学分析，从而筛选并鉴定ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4的差异性相互作用蛋白。利用Oncomine数据库检索分析可能与ZWINT-1v4存在相互作用的蛋白在食管癌组织及正常组织中的表达情况，从而对新选择性剪接亚型ZWINT-1v4与食管癌之间可能存在的联系进行初步探究。　　结果：将重组真核表达质粒的测序结果与NCBI提供的ZWINT-1(isoforma，NM_007057.4)参考序列进行比对分析，证实ZWINT-1及其新选择性剪接亚型ZWINT-1v4编码序列已成功克隆到真核表达质粒pcDNA3.0-puromycin中。将重组真核表达质粒pcDNA3.0-Flag-ZWINT-1v1-6×His和pcDNA3.0-Flag-ZWI

关 键 词： 食管癌 相互作用蛋白 选择性剪接亚型

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