导　　师： 何小维

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： C-反应蛋白(CRP)作为急性反应蛋白的主要蛋白，是一种针对疾病和监测治疗的很重要的标志物。CRP对疾病高度敏感，在疾病发生早期迅速上升，此标志物同样适用于犬类。建立一种方便快速、特异性强和灵敏度高的检测方法对于宠物犬的疾病防控和治疗具有重要意义。因此，本研究基于免疫学和层析技术原理的建立了犬CRP(CCRP)荧光定量免疫层析检测方法。　　本研究采用CCRP重组蛋白作为免疫原，经皮下多次免疫BALB/C小鼠，最终免疫后小鼠的抗血清效价可达到1∶106;通过连续亚克隆和间接ELISA检测从87株杂交瘤细胞株中最终筛选出2株可稳定分泌抗CCRP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株，分别命名为2C5，2G8;经过小鼠腹腔内诱生产出腹水的效价均大于1∶106;辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，经SDS-PAGE纯度鉴定显示所制备抗体与购买的阳性对照抗体无显著差异，经间接ELISA检测效价可达1∶105;Western-blot结果显示，所制备的单抗与CCRP抗原有两条明显特异性结合带，特异性良好。　　本研究经优化成功制备了CCRP免疫荧光微球;荧光光谱仪分析荧光微球偶联抗体后荧光强度未有明显的降低，基本没有发生荧光猝灭;场发射扫描电镜(SEM)观察荧光微球偶联CCRP抗体后未发生团聚，形态比较稳定、均一;动态光散射(DLS)和Zeta电位对制备的CCRP免疫荧光微球的稳定性进行表征，结果表明在一定条件下CCRP免疫荧光微球的稳定性有所提高。最终优化的偶联活化时间为20min，EDC和NHS使用量均为5mg，CCRP抗体标记使用浓度为600μg/mL，偶联时间为2h，MES缓冲体系pH=6.0。　　通过荧光免疫层析检测法筛选CCRP配对抗体，并且对试纸条的工艺条件进行优化，最终确定所构建试纸条参数：C线上鸡IgY的浓度为0.5mg/mL，标记抗体与包被抗体距离为0.6cm，T线上CCRP抗体浓度为2mg/mL，T线和C线上�

关 键 词： 犬 反应蛋白 单克隆抗体 荧光定量免疫层析 快速检测