导　　师： 李国新

学科专业： J0210

授予学位： 博士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 目的通过对 MicroRNA 145、Adducin3 及 GBP-1 在胆道闭锁(biliary atresia,BA)患儿肝脏组织中的表达水平变化,探讨MicroRNA145-Adducin3通路及GBP-1在胆道闭锁发病中增殖紊乱的作用及其作用机制。方法选取深圳市儿童医院2013年1月至2016年1月收治的临床及病理诊断为胆道闭锁的患儿60例(研究组),对照组选取同期年龄在6个月之内的非胆汁淤积性肝病且肝功能正常的患儿54例。第一部分:通过裂解研究组及对照组的肝组织并提取其总RNA后,分别用mRNA RT-PCR及MicroRNA RT-PCR法反转录、qPCR荧光定量分析法,检测BA肝组织中的ADD3 mRNA及MicroRNA-145的表达水平。第二部分:构建高表达MicroRNA-145、低表达Microma-145慢病毒,并分别转染至HepG2细胞内,用RT-PCR反转录及qPCR荧光定量、western blot方法分别检测不同MicroRNA-145表达量的细胞内ADD3 mRNA表达水平和蛋白表达水平。第三部分:检测GBP-1在不同程度肝脏纤维化肝脏组织中的表达,并利用自动医学彩色图像分析系统对其进行定量。第四部分:拟构建GBP1基因慢病毒载体,转染肝脏细胞从而上调其在肝脏细胞中的表达,探讨该基因高表达后对其下游因子尤其是MMPs表达的影响及对肝脏细胞的影响。结果第一部分:ADD3mRNA在BA组肝组织中表达量为4.638±0.3327,在对照组中表达为1.167 ± 0.1053;MicroRNA-145在BA组肝组织中表达为0.1578±0.03217,在对照组中表达为0.4557±0.1244。BA组肝组织中ADD3较对照组的明显升高(p<0.05),MicroRNA-145较对照组的明显降低(p<0.05)。第二部分:空白对照组的HepG2细胞内存在ADD3 mRNA及蛋白质的基础表达量,转染高表达MicroRNA-145后的HepG2细胞,其ADD3mRNA水平及蛋白质水平均较对照组细胞的低,而转染低表达MicroRNA-145后的细胞,其ADD3mRNA水平及蛋白质水平均明显低于对照组细胞。第三部分:GBP1在对照组肝脏组织中呈阴性表达;在BA肝脏组织中呈现不同程度表达,随着肝脏纤维化程度的加重,GBP-1表达水平增高。第四部分:TUNEL法检测HepG2凋亡情况发现,空载体质粒和未转染对照HepG2细胞未检测到凋亡,而转染Pcmv6-gbp1的HepG2细胞出现较多凋亡细胞。ELISA定量检测发现,MMP-1和MMP-2在pCMV6-gbp1转染HepG2细胞上清中表达降低,与对照组和空载体质粒组统计学差异(P<0.05)。结论1、ADD3的过度表达可能与BA的发病相关。2、MicroRNA-145可能通过靶向作用于ADD3 3’UTR序列来改变ADD3的表达,而诱发了 BA的发生。3、GBP1可能与BA肝脏组织肝纤维化密切相关。4、GBP1可能通过促进肝细胞凋亡和抑制MMP-1和MMP-2的表达而导致胶原酶降解减低,从而引起了 BA的发生。但由于本研究只是在细胞水平的研究,需要进一步在动物水平上进行验证。更多还原

关 键 词： [70316]胆道闭锁 MicroRNA-145 Adducin3 GBP1 [6958109]肝纤维化 [90830]蛋白质组

分 类 号： [R725.7]

领　　域： []