导　　师： 李爽

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 随着基因组学和蛋白质组学的发展,越来越多的重组蛋白被表达出来。然而,在表达之后,这些重组蛋白需要进行纯化回收,以便后续的研究或应用。在工业和医疗领域重组蛋白的生产规模一般较大,但是下游纯化回收非常昂贵,可以占到总生产成本的约80%。因此,重组蛋白的快速且经济的纯化方法研究是当今生物技术领域的一大挑战。传统的重组蛋白纯化一般会涉及离子交换、凝胶过滤、亲和层析等步骤,制药行业甚至用到反相色谱。这些纯化步骤不仅昂贵、费时,同时产物得率非常低。近年来,有一类自组装短肽,如18A、R18A、ELK16和L6KD,根据其可诱导形成活性蛋白质聚集体的特性,将其应用于无柱重组蛋白纯化,从而可以快速、高效、经济地纯化得到重组蛋白。本研究将四个自组装肽分别添加到来源于嗜热厌氧菌SCUT27的β-木糖苷酶（β-xylosidase,ThXylC）和来自短小芽孢杆菌PS213的乙酰木聚糖酯酶（acetylxylan esterases,AXE）的C端。在E.coli BL21（DE3）中诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,AXE-18A、AXE-R18A、AXE-ELK16和AXE-L6KD自聚集率分别为79.3%、99.49%、93.54%和91.06%,酶活性回收率分别达到69.33%、87.69%、87.70和99.17%。而对于β-木糖苷酶,只有ELK16可成功诱导活性聚集体的形成,ThXylC-ELK16的自聚集率达到98.6%,其纯化回收率和终产物纯度分别为92.57%和95%。对各种形态的β-木糖苷酶和乙酰木聚糖酯酶的动力学研究发现,相较于常规表达酶,酶活性聚集体Km都有不同程度增大,这可能是由于酶的聚集造成底物与酶催化活性中心接触造成空间位阻,从而降低了底物与酶的亲和力。酶的催化特性表征结果显示,ThXylC-ELK16相较于ThXylC最适反应温度提升约5oC,且在65 oC半衰期为后者的6.2倍。此外,ThXylC-ELK16催化效率(Kcat/Km)为32.19mM-1 s-1,是ThXylC的1.5倍。本研究还基于稳定性及催化效率优选AXE-L6KD与AXE-His

关 键 词： 木糖苷酶 乙酰木聚糖酯酶 自组装短肽 热稳定性 氨基头孢烷酸

领　　域： []