导　　师： 张荣华

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的:研究线粒体信号通路和JNK通路对氯化镉诱导MC3T3-E1 Subclone14细胞凋亡的影响,以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对氯化镉诱导细胞凋亡的作用,为防治镉引起的骨代谢疾病提供理论基础。方法:1.CCK-8法检测EGCG与氯化镉对细胞存活率的影响。2.ALP试剂盒检测EGCG与氯化镉对细胞ALP活力的影响。3.光学显微镜观察氯化镉对细胞形态的影响,Annexin V-FITC/PI、Hoechst和TUNEL荧光染色法观察氯化镉对细胞凋亡的影响。4.JC-1法检测EGCG与氯化镉对细胞线粒体膜电位的影响。5.QPCR法检测EGCG与氯化镉对细胞转录因子RUNX2、I型胶原COL-1和凋亡相关基因Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表达的影响。6.免疫荧光法检测Z-VAD-FMK与氯化镉对细胞cleaved-caspase 3蛋白表达的影响。7.Western-blot法检测Z-VAD-FMK、SP600125、EGCG与氯化镉对细胞成骨相关蛋白RUNX2、COL-1、ALP和凋亡相关蛋白Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表达以及JNK、p-JNK蛋白表达的影响。结果:1.与对照组比较,5、10、20、30、40、50、100μM氯化镉单独处理细胞60 h后,细胞存活率均显著降低(P<0.01);10μM氯化镉能诱导细胞凋亡;5、10、20μM氯化镉能明显降低细胞Caspase 9、Cytoc蛋白的表达和Bcl-2/Bax的比值(P<0.05),升高p-JNK/JNK比值(P<0.05);5、10、20μM氯化镉显著性降低RUNX2、COL-1基因表达(P<0.01);20μM氯化镉能明显抑制ALP活性并降低RUNX2、COL-1蛋白表达(P<0.05),而5、10μM氯化镉对其无统计学意义(P>0.05)。2.Caspase抑制剂Z-VAD-FMK与20μM氯化镉单独或联合处理细胞60 h后,未处理组细胞呈纤维状,氯化镉处理组细胞皱缩呈圆泡状,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理后细胞皱缩数目减少;与氯化镉单独处理组比较,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理组能显著升高Caspase 9蛋白表达和Bcl-2/Bax的比率,并使cleaved-caspase 3蛋白表达显著性降低(P<0.05);与氯化镉单独处理组比较,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理组显著升高RUNX2蛋白的表达(P<0.05),而对ALP、COL-1无统计学意义(P>0.05)。3.JNK抑制剂SP600125预处理1 h,20μM氯化镉干预细胞60 h后,SP600125能改善镉引起的细胞形态变化,显著降低镉引起的JNK磷酸化水平的升高并显著抑制Bcl-2/Bax比值的降低(P<0.01或P<0.05),而对镉降低的凋亡相关蛋白Caspase 9、Cytoc以及成骨相关蛋白RUNX2、ALP和COL-1表达无统计学差异(P>0.05)。4.EGCG与氯化镉单独或共同处理细胞60 h后,与氯化镉组比较,EGCG与镉联合处理组细胞存活率和线粒体膜电位显著性升高;Caspase 9基因和蛋白表达及Bcl-2/Bax的比率显著性增加,p-JNK/JNK比值明显降低(P<0.05);ALP活性明显升高(P<0.05)。结论:1.氯化镉能降低MC3T3-E1 Subclone14存活率并诱导细胞凋亡;抑制ALP活性并下调RUNX2、COL-1基因和蛋白的表达;2.氯化镉通过线粒体Caspase依赖型途径和激活JNK通路诱导细胞发生凋亡;3.EGCG能降低镉诱导的细胞损伤率和细胞凋亡率,其保护作用可能是通过上调Caspase 9和Bcl-2/Bax比值并下调p-JNK/JNK比值来实现的。更多还原

关 键 词： 镉 [8394385]EGCG MC3T3-E1 Subclone14细胞 [4162942]线粒体凋亡途径 [8600006]JNK

分 类 号： [R99]

领　　域： []