导　　师： 蔡更元;张献伟

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 非淀粉多糖和植酸均是存在于饲料中的主要抗营养因子,能显著降低猪对饲料氮和磷的消化率,并造成氮、磷污染。前期研究中,本课题组已制备一种唾液腺共表达葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的转基因猪,具有显著的节粮和减排功效,但该猪不能消化纤维素,其目的基因表达量还不够理想。其转基因方式为piggybac转座子介导随机整合,不利于转基因新品系的培育。为弥补上述缺陷,进一步改善转基因猪节粮和环保性能。本研究在前人研究基础上,旨在构建一种唾液腺特异、高效、共表达纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶定点整合转基因载体,为新一代环保猪的制备奠定基础。本研究利用CRISPR-Cas9系统介导的定点整合转基因技术将XABT敲入猪内源PSP基因的终止密码子前,利用鼠源PSP启动子调控XABT基因融合表达,获得定点整合转基因细胞系。主要研究成果如下:（1）比较2A和A3两种连接肽作用效果,A3明显优于2A,并获得木聚糖酶、植酸酶、葡聚糖酶和纤维素酶基因多顺反子XABT。（2）对目的基因XABT产物蛋白的致敏性和毒性分析结果显示,XABT产物蛋白不存在安全隐患。（3）借助同源重组技术,重组PSP启动子,并将其克隆到猪Cep112位点,获得定点打靶质粒。（4）分别将Cas9表达载体sgRNA-Cas9与三个优化启动子同源打靶质粒共转染PFF细胞,获得Cep112定点整合XABT阳性细胞系。

关 键 词： 定点整合 位点 基因细胞系

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