导　　师： 王永华;冯国华

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 生物酶参与的氧化反应是一种绿色化学反应过程,但酶蛋白在氧化底物HO存在的条件下均易被氧化而失活。脂肪酶是一种能够介导进行环氧化反应的极具应用前景的酶类,但现有研究仍然缺乏有效方法提高酶耐受HO的能力,限制了其应用范围。本文以卡门柏青霉菌脂肪酶PCL(Penicillium camembertii lipase,PCL)为研究对象,通过探究脂肪酶PCL催化口袋与HO的关键结合位点,采用蛋白质工程技术进行分子改造,获得对HO耐受能力提高的脂肪酶PCL变异体。本研究为理性设计以提高工业酶的氧化稳定性提供了新的研究思路。(1)脂肪酶PCL的生物信息学分析。通过同源建模,获得了脂肪酶PCL的开放构象。使用分子对接构建了脂肪酶PCL-HO-戊酸的复合物构象,进一步分析脂肪酶PCL催化口袋中与HO的结合情况,并确定脂肪酶PCL催化口袋中与HO结合的重要位点Y21和H144。(2)通过突变实验推断脂肪酶PCL氧化失活的原因。构建酶与HO结合位点的突变体Y21F和H144W,用于模拟Y21和H144被氧化而极性消失的情况。实验结果表明,突变体Y21F和H144W的酶活力显著降低,在1 M HO浓度下孵育2 h后分别丧失了50%及80%的酶活力,相较之下PCL野生型仅丧失15%的酶活力,由此推测结合位点Y21和H144对将HO稳定在底物结合口袋中及维持酶催化效率起到重要作用。另外,结构分析表明酶催化口袋中Y21、H144和H259之间能够形成氢键,有助于稳定酶分子的催化口袋并将催化三联体中H259维持在合适的构象。(3)分子改造脂肪酶PCL提高其耐受HO能力的研究。设计在酶分子催化口袋中重要位点Y21和H144上方引入氢键供体,将脂肪酶PCL中HO结合口袋内非极性氨基酸替换为极性氨基酸,同时结合传统改造方法,共构建了8个突变体。其中突变体Y84R、I260E及I260R耐受HO能力都较野生型有了显著提高。分子对接实验表明它们都能与HO形成氢键相互作用,将H

关 键 词： 脂肪酶 耐受性 分子改造 烯烃 环氧化反应

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