导　　师： 吴珍芳

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 体细胞核移植技术已经被广泛应用，但是克隆效率低下一直是制约克隆技术发展的主要原因之一。有研究表明，克隆效率低下是由于克隆胚胎中X染色体异常失活导致的，在小鼠中通过敲除供体细胞XIST基因或者利用RNAi技术干扰早期胚胎中XIST基因表达，均能显著提高小鼠的克隆效率。尽管在小鼠上通过基因敲除和RNAi技术抑制 XIST基因表达均可以显著提高小鼠克隆胚胎发育效率，但两种方法能否提高猪克隆胚胎发育效率仍然未知。本论文以两种猪体细胞，包括野生型公猪PK细胞（WT）和本实验室前期获得的XIST基因敲除公猪PK细胞（KO）为材料作为供体细胞进行核移植，收集桑葚胚时期两组胚胎，通过转录组测序比较处理组与对照组胚胎基因表达差异。本试验同时比较了突变 XIST基因胚胎相较于野生型对照组胚胎的体内发育效率。本试验同时针对猪XIST基因设计了四组小干扰RNA靶序列，筛选了最佳的干扰序列，使用最佳干扰序列合成了普通的s iRN A，化学修饰的s iRN A，并构建了表达靶向序列发夹结构的质粒表达载体，筛选了干扰作用时间最长的干扰形式。在猪核移植胚胎二细胞期进行包浆注射，对照组注射等体积的水，比较注射组胚胎体外发育效率及相关基因表达情况。本试验获得如下结果：（1）shRNA质粒表达载体转染细胞，其干扰效果持续时间最久，化学修饰的siRNA干扰效率最低;（2）二细胞期注射shRNA质粒表达载体，在囊胚期仍然可以有效干扰XIST基因表达（P<0.05），且显著提高了X染色体连锁基因表达量（P<0.05）;（3）二细胞期注射10pL5ng/μL shRNA质粒表达载体，显著抑制了XIST基因表达水平（P<0.05），但是相较于对照组，其平均囊胚细胞数和囊胚率没有显著差异;（4）以敲除 XIST基因的细胞系做供体细胞，显著提高了克隆胚胎中X染色体�

关 键 词： 猪克隆胚胎 基因表达 发育效率

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