导　　师： 胡萍;李晓帆

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 深圳大学

摘　　要： 黑曲霉是重要的细胞工厂之一,广泛用于工业上各类酶制剂和有机酸的生产。以淀粉为原料的加工过程中,利用α-葡萄糖苷酶的转糖苷作用能生成低聚异麦芽糖。黑曲霉产α-葡萄糖苷酶时往往伴随着糖化酶而抑制其转苷能力,其代谢机制不明确。在本研究中,我们首先通过分子遗传手段构建糖化酶基因galA缺失的黑曲霉突变株,获得了α-葡萄糖苷酶活升高的菌株;其次在代谢组水平和转录组水平分析基因缺失导致的差异代谢物及转录本,构建差异代谢通路以确认黑曲霉产α-葡萄糖苷酶与糖化酶过程中关键因素;最后使用筛选到的关键代谢物进行添加培养,以验证本方法的有效性。首先利用已构建好的敲除表达盒galA1-N、N-galA2重新转化黑曲霉出发株HE01的原生质体,获得糖化酶基因缺失的△galA后,测定α-葡萄糖苷酶活和糖化酶活随时间的变化曲线,确定黑曲霉HE01和△galA代谢组和转录组分析的最适时期:在产酶发酵培养第168 h,两菌株的两种酶活均表现最高。其次选择最适时期的黑曲霉菌体快速冷冻一部分做代谢物制备,另一部分做RNA提取。一部分菌体采用真空冷冻干燥后甲醇水溶液进行少量多次冰水浴超声提取进行核磁共振NMR测试,对H NMR谱图进行信号归属,共指认出26种化合物,为初级代谢物包括糖类、氨基酸及胆碱类等。再对谱图分段积分归一化处理采用正交偏最小判别二乘法(OPLS-DA)分析,共筛选到两种构型的葡萄糖、海藻糖、丙氨酸、谷氨酸、甜菜碱、胆碱7种在△galA比HE01中上调代谢物及甘氨酸、肌氨酸、乙酸、乙醇4种下调代谢物。另一部分菌体提取RNA后进行高通量转录组测序,对黑曲霉产α-葡萄糖苷酶活最高时期的胞内所有mRNA进行一个相对定量分析:黑曲霉HE01和△gal A中,galA转录水平是所有编码蛋白中转录水平最高的,分别是内参基因GAPDH转录水平的近

关 键 词： 黑曲霉 葡萄糖苷酶 核磁共振 代谢组 转录组测序 代谢途径

领　　域： []