导　　师： 何孔旺;黄运茂

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 仲恺农业工程学院

摘　　要： T7噬菌体因其具有的结构简单,操作方便等特点,作为噬菌体表面展示技术的载体之一,能够快速方便的用于抗原、抗体的筛选,被广泛应用于兽医研究的各个领域。本研究以T7噬菌体裂解机理为基础,通过构建缺失裂解调控基因穿孔素(Holin)的重组T7噬菌体(T7-△Holin),来探究T7噬菌体裂解周期与子代病毒粒子产量之间的对应关系,通过建立荧光定量评价方法、优化培养过程工艺参数,最终确定Holin缺失株T7噬菌体高效培养方法,为大规模、低成本生产T7噬菌体奠定基础。实验一,通过PCR方法拼接缺失Holin基因的T7噬菌体基因组,并构建表达Holin蛋白的补偿宿主用于拯救缺失株T7-△Hilon重组噬菌体。PCR扩增Holin基因,分别在基因的5’端添加Xba I和RBS序列、3’端添加BamH I位点,然后插入pET-28载体构建重组质粒pET-Holin。将重组质粒化学转化法导入大肠杆菌BL-21(DE3),构建补偿宿主菌BL-Holin。IPTG诱导Holin蛋白表达,SDS-PAGE鉴定目的蛋白。分析T7噬菌体全基因组,选择Holin基因上游Sfi I位点以及下游非编码区作为分段位点。酶切回收Sfi I位点左侧基因组、SOE-PCR方法扩增缺失SfiI到非编码区基因片段、常规PCR扩增非编码区右侧基因组,包装蛋白包装三者的连接产物并在补偿宿主中拯救T7-△Holin重组噬菌体。结果显示,构建的补偿宿主能够正确表达Holin蛋白,并能在其中顺利拯救T7-△Holin重组噬菌体,测序结果表明Holin基因被正确敲除,缺失株噬菌体能够稳定传20代,显示出良好的遗传稳定性。实验二,由于传统斑计数法评价噬菌体颗粒数量存在效率低、通量小、结果不准确等缺点,为了更好的研究T7-△Holin的生物学特性,建立了基于qRT-PCR的噬菌体颗粒评价方法。首先通过梯度密度离心方法进行了T7噬菌体样品的纯化,将纯化T7噬菌体样品进行倍比稀释作为模板,通过qRT-PCR建立起标准曲线,得到CP�

关 键 词： 噬菌体 穿孔素 基因缺失 反向遗传拯救 生物学特性

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