导　　师： 何祥久

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 广东药科大学

摘　　要： 开口箭（Tupistra chinensis Baker）是我国传统药用植物,对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用,甾体皂苷是开口箭的主要活性成分,然而其甾体皂苷类化合物的抗肿瘤作用的分子机制尚不明确。研究开口箭中甾体皂苷类化合物对肿瘤细胞的凋亡以及自噬两种程序性死亡的作用,阐明其抗肿瘤作用的分子机制,对于开口箭的进一步开发具有重要意义。本实验研究旨在阐明从开口箭中分离得到的其中一个甾体皂苷类化合物5β-spirost-25（27）-en-1β,3β-diol-1-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-xylopyranosyl-3-O-α-L-rhamnopyranoside（SPD）抑制人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞增殖的分子机制。在前期研究基础上,本研究采用人肝母细胞瘤HepG2细胞和人急性髓性白血病HL-60细胞作为研究对象,用MTT法检测SPD对细胞存活率的影响（阳性对照为顺铂）,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况,流式细胞术观察细胞周期分布变化,用JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化,利用Western blot法分析线粒体通路上凋亡相关蛋白（PARP、caspase-3、caspase-9、Bax和Bcl-2等）的表达情况,阐明SPD诱导细胞凋亡的分子机制。另一方面,本研究运用MDC染色法初步确定细胞自噬的发生,对HepG2细胞进行GFP-LC3质粒的转染,在荧光显微镜下观察自噬标志性蛋白LC3-II的聚集从而确认自噬的发生,通过Western blot技术分析自噬相关标志性蛋白（p62、Beclin-1和LC3）的表达情况,以及自噬经典通路Akt/mTOR/p70S6K信号通路中下游关键蛋白的表达变化情况,阐明SPD诱导细胞发生自噬作用的分子机制。为进一步研究自噬与细胞凋亡、自噬与细胞死亡之间的相互关系,本研究采用自噬抑制剂Baf-A1联用SPD,利用MTT法检测细胞增殖情况;通过Western blot法检测凋亡相关主要蛋白的表达情况,阐明SPD诱导的细胞自噬在细胞凋亡以及细胞存活

关 键 词： 甾体皂苷 开口箭 细胞凋亡 细胞自噬 线粒体途径

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