导　　师： 余榕捷

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的:垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体1(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptor 1,PAC1-R)属于B类G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs),是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的优先受体,介导显著的神经保护活性,是神经系统疾病药物靶点。使用细胞穿膜肽TAT(YGRKKRRQRRR)来增强神经肽血管活性肠肽(Vasoactive intestinal polypeptide,VIP)的穿透活性时,偶然发现TAT标记(VIP-TAT)可促进PAC1-R弱激动剂VIP对PAC1-R的激活,并且TAT与PACAP(28-38)具有类似的二级结构;本研究使用计算机分子对接(Molecular docking)、微量热电泳(Microscale thermophoresis,MST)以及c AMP测定分析法,探索TAT对PAC1-R的别构调节作用(Allosteric modulator,AM)。方法:利用PAC1-R sh RNA以及PAC1-R拮抗剂PACAP(6-38)确定PAC1-R介导了TAT、VIP-TAT保护小鼠神经瘤母细胞Neuro2a抗东莨菪碱(Scopolamine)诱导凋亡的活性。使用计算机分子对接和微量热电泳(MST)测定来确定TAT与PAC1-R的N端胞外结构域(PAC1-EC1)的结合。然后利用高表达PAC1-R和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,e GFP)融合蛋白的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary cells,CHO)细胞PAC1-CHO结合c AMP测定检测TAT单独及其协同VIP激活PAC1-R可能产生的正向别构调节剂(Positive allosteric modulator,PAM)作用。利用一系列内化抑制剂,包括网格蛋白(Clathrin)抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)、小凹(Caveolae)抑制剂β-环糊精(β-cyclodextrin)和大胞饮(Micropinocytosis)抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin),进一步探索TAT和VIP-TAT激活PAC1-R、诱导PAC1-R的内化机制。结果:PAC1-R sh RNA和PAC1-R拮抗剂PACAP(6-38)(10n M)有效抑制TAT(1n M)和VIP-TAT(1n M)对抗东莨菪碱诱导Neuro2a细胞凋亡的神经保护活性,证实PAC1-R介导TAT和VIP-TAT的神经保护作用。计算机分子对接表明TAT与PAC1-R的N端胞外结构域(N-terminal extracellular d

关 键 词： 类 蛋白偶联受体 垂体腺苷酸环化酶激活多肽受体 细胞穿膜肽 神经保护活性 别构调节 内化

领　　域： []