导　　师： 王斌; 吴新良

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 单宁酰基水解酶（单宁酶,EC3.1.1.20）可催化单宁的水解,广泛应用于皮革、制药、饮料和食品工业。目前主要应用于茶叶、橡子酒和生产没食子酸。同时,单宁酶可用作果汁澄清剂和咖啡软饮料的调味剂,有助于减少单宁对茶饮料和食品中的不利影响;用于动物食品制剂中作为添加剂,提高动物的消化率;用于环境生物技术,例如处理富含多酚类物质的制革废水。产单宁酶微生物种类繁多,在大部分真菌、细菌和酵母中均存在,其中曲霉菌属产单宁酶量最高。本文以一株低蛋白背景的黑曲霉菌株为出发菌株,构建单宁酶黑曲霉表达系统,对黑曲霉基因组中单宁酶基因进行挖掘,筛选出单宁酶酶活最高的菌株,并对其酶学性质进行研究,主要研究了以下内容:（1）从AspGD数据库中找到黑曲霉中有17个与单宁酶有关的基因,将其氨基酸序列进行比对进行系统进化树分析。利用同源重组原理成功构建出17个单宁酶的黑曲霉过量表达菌株。（2）利用适合测定胞外单宁酶酶活的可见分光光度法,对17株重组单宁酶菌株进行酶活的测定及蛋白含量的测定,最后筛选出单宁酶酶活最高的一株黑曲霉转化株Bdel4Tan7,发酵液上清第168 h酶活最高达到111.9 U/m L,粗酶液中单宁酶纯度达到70%。上罐发酵液第138 h时酶活力达到最高为1385.5 U/m L,比摇瓶发酵液酶活提高了十倍以上,表明成功构建出一株可用于工业化大量生产单宁酶的重组单宁酶菌株。（3）通过脱盐和凝胶过滤层析将重组单宁酶Bdel4Tan7进行纯化,纯化后单宁酶纯度达到90%以上。重组单宁酶分子量大小约为85 kDa,用糖苷酶PNGase F去糖基化验证得到该重组单宁酶是一个糖蛋白。且重组单宁酶的最适pH为7.0,最适温度为40°C。加入K+、Na+或Cd2+对单宁酶酶活的测定影响不大,加入Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ni2+或Na2EDTA明显抑制单宁酶活力,而加入1 mM的Mn2+

关 键 词： 黑曲霉 重组表达 单宁酶 基因筛选

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