导　　师： 琚春梅

授予学位： 硕士

作　　者： ;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 伪狂犬病（Pseudorabies,PR）作为常见二类动物疫病,在世界范围内广泛流行,严重制约着世界生猪养殖业的发展。由于其病原伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）具有隐性感染以及神经嗜性等特性,一直难以得到根除。借鉴欧美地区伪狂犬病根除案例,我国于上世纪80年代引进匈牙利Bartha-K61疫苗进行伪狂犬病根除计划,伪狂犬病在我国得到有效控制。但自2011年末以来,国内多地经Bartha-K61疫苗免疫猪场相继爆发伪狂犬病疫情,分离鉴定发现病原为伪狂犬病毒突变株,致病性更强,呈现出新一轮伪狂犬病流行趋势。目前应用的PRV疫苗对伪狂犬病毒新流行毒株的感染不能提供完全保护,因此大量学者已开始针对伪狂犬病毒新流行毒株进行疫苗研究。本研究以实验室前期构建的标记有绿色荧光蛋白基因（EGFP）的g I/g E缺失毒株r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+为材料,利用同源重组原理在r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+基因组g I/g E缺失位置插入g B外源表达盒序列,筛选出高效表达g B基因的重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+,并在昆明小鼠体内评估其免疫原性。主要研究内容如下:1.重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+的构建与生物学特性分析实验室前期分离得到国内PRV新流行毒株PRV-AH-China-2013（以下简称PRV-AH）,并构建了g I/g E缺失毒株r PRV-AH-g I-/g E-和r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+。在此基础上,本研究扩增g B编码区序列并在3’末端标记His标签序列,克隆到哺乳动物真核表达质粒p CDNA3.0多克隆位点上,然后扩增得到g B外源表达盒序列CMV-g B-SV40 poly A,并克隆至前期构建的g I/g E同源臂质粒p MD-LA-RA,获得重组质粒p MD-LA-g B-RA。通过脂质体转染法将质粒转染到BHK-21细胞,并侵染病毒r PRV-AH-g I-/g E-/EGFP+,待二者在BHK-21细胞中充分同源重组后,结合空斑纯化与极限稀释法,筛选获得重组病毒r PRV-AH-g I-/g E-/g B+。PCR测序结果显示g B外源表达盒序列

关 键 词： 拷贝 基因 重组伪狂犬病毒 缺失 构建