导　　师： 郑青

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 目的:通过生物信息学方法分析甲型流感病毒H5/H7/H9及N2/N6/N9亚型非翻译区(UTR)多态性位点,利用自主构建的以EGFP为报告基因的RNA聚合酶I报告系统,构建以RNA聚合酶I荧光报告系统为骨架,含有H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR随机突变位点的随机突变基因库。从HA/NA-UTR随机突变库中挑选突变系统,定性及定量地分析目的报告基因表达情况,以此探究UTR多态性位点突变对甲型流感病毒HA及NA基因表达的影响。方法:1、流感病毒HA/NA基因UTR序列特征分析:2013-2015年间深圳市监测的人感染H5N6,H7N9流感病毒及环境监测H9N2流感病毒进行序列测序。测序结果结合NCBI数据,分析H5/H7/H9及N2/N6/N9-UTR多态性序列特征:利用MEGA软件对各HA/NA-UTR序列构建进化树;利用DNAstar软件对HA/NA-UTR序列进行突变位点分析,获得在自然进化过程中UTR突变位点信息。人为地将各亚型UTR突变位点设计为N碱基(含A、T、C、G),以引物的形式用于构建含UTR随机突变的RNA聚合酶I荧光报告系统;2、RNA聚合酶I荧光报告系统的改造:将RNA聚合酶I人源性启动子PIh、鼠源性终止子t1及Bsmb I酶切位点插入到不含T7启动子的p MD18-T克隆载体中构建RNA聚合酶I元件系统。以A/chicken/Beijing/0309/2013(H9N2)为野生型,将其HA/NA-UTR序列及报告基因EGFP序列克隆至RNA聚合酶I元件系统,并转染至染毒的MDCK细胞。3、H5/H7H9及N2/N6/N9-UTR随机突变基因库构建:将含有N碱基的各亚型HA/NA-UTR序列及报告基因EGFP序列克隆至RNA聚合酶I元件系统,构建H5/H7H9及N2/N6/N9-UTR随机突变基因库,计算基因突变库容量,各亚型随机挑选10个阳性克隆测序。4、报告基因上调筛选及鉴定:经测序鉴定的HA/NA-UTR-RNA聚合酶I荧光报告系统转染至染毒的MDCK细胞,通过荧光显微镜观察报告基因EGFP表达、多功能酶标仪测定报告基因EGFP的相对荧光值及RT-PCR检验报告基因EGFP的相对表达量,筛选出导致报告基�

关 键 词： 甲型流感病毒 非翻译区 聚合酶 系统 基因突变库

领　　域： []