导　　师： 李雁群;查玉兵

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广东海洋大学

摘　　要： 为了探究3-酮脂酰-CoA合酶（KCS酶）对于小球藻脂肪酸代谢过程的调控作用,增加超长链不饱和脂肪酸的含量,本文采用农杆菌介导法将碎米荠KCS酶基因转入过表达硬脂酰载体蛋白去饱和酶（SAD酶）基因的改造蛋白核小球藻中,观察外源基因的转入对小球藻脂肪酸合成的影响。实验以pCAMBIA1301质粒为载体转化KCS基因,通过潮霉素抗性筛选阳性转化藻,用相同质粒载体转化GUS基因观察小球藻对所用表达盒的表达能力,采用PCR和RT-PCR验证碎米荠KCS酶基因阳性转化藻,利用高效液相色谱（HPLC）分析脂肪酸合成代谢中间产物,用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法对其分析小球藻脂肪酸组成。本文所完成的基因转化是在前期完成了SAD基因转化的基础上通过农杆菌介导法进行的二次转化,首次获得了同时转化了SAD酶基因与KCS酶基因的蛋白核小球藻,并探究了KCS酶对小球藻脂肪酸合成的影响,为深入探究小球藻脂肪酸代谢的调控机理提供了研究参考。本研究的主要内容及结果如下:（1）成功构建了以双元载体pCAMBIA1301为基础,通过敲除GUS基因,连入碎米荠KCS基因改造而成的重组质粒pCAMBIA1301-KCS,该重组质粒是以原GUS基因表达盒的CaMV35S启动子和NOS polyA终止子为启动子和终止子构建了新的碎米荠KCS基因表达盒。（2）利用农杆菌介导法分别将含GUS基因的原始双元载体pCAMBIA1301和改造质粒pCAMBIA1301-KCS分别转入过表达SAD基因的改造小球藻,通过潮霉素抗性筛选出阳性转化小球藻,并将筛选出的转化小球藻在潮霉素压力下扩大培养。（3）对转入pCAMBIA1301的阳性转化小球藻进行GUS染色,结果表明GUS基因可以在小球藻内成功表达,即GUS基因的表达盒能够在小球藻内有效。（4）对转入pCAMBIA1301-KCS的阳性转化小球藻进行了PCR鉴定,验证了碎米荠KCS基因和潮霉素抗性基因（Hpt）成功转入了小球藻,对

关 键 词： 蛋白核小球藻 农杆菌转化 酶 超长链不饱和脂肪酸

领　　域： []