导　　师： 赖小平

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种多因素诱导的难愈性消化道疾病,因病理机制复杂,受到多种因素的共同影响,IBD的病理机制和治疗方案仍不明确。目前针对炎症性肠病的致病原因主要涵盖了环境、遗传、饮食和免疫等多方面。治疗方案多以抗炎抗菌和提高免疫力等治疗方案为主,很难取得满意的治疗效果。因此IBD的致病因素和诱导机制的研究成为热点研究问题,相关研究能够为预防IBD的发生以及开发新药提供实验参考。伴随着经济社会的发展和生活水平的提高,IBD在发展中国家的发病率显著上升,提示饮食结构变化可能对IBD有一定的影响。不同的饮食文化对机体的影响是全方位的,“病从口入”从广义上来说,就是不良的饮食习惯会导致疾病的发生发展,而食物的消化吸收以及排泄等过程直接和肠道相关,那么饮食结构的变化究竟是如何影响肠道的健康呢?这一问题值得深入研究。前期研究中,发现高脂饮食能够诱导动物出现明显的肥胖,但结肠损伤不明显,而高浓度灌胃酒精可以诱导结肠出现明显的炎性浸润,并有轻度的结肠损伤,在高脂饮食合并低浓度的酒精时,动物出现严重的结肠炎症和结肠损伤,这一结果提示,在复合饮食的诱导下,动物的结肠损伤情况加剧,出现明显的病理学损伤,但混合饮食诱导结肠损伤的机制仍不清晰。近年来,肠道菌群以及肠道有毒代谢物对机体的影响的相关研究受到广泛关注。机体有毒代谢物质范围广泛,大多数能够被身体免疫功能清除排泄,但是在菌群严重失调时可能会导致诸如脂多糖（LPS）以及吲哚类毒素物质的含量升高,在长期的不良饮食诱导下,肠道菌群紊乱,内源性的毒素和LPS的累积,持续刺激结肠免疫系统和上皮细胞,最终会诱导结肠炎症,在长期慢性炎症的诱导下,机体的免疫系统可能出现崩溃,最终导致结肠炎症的出现。但是其相关机制目前仍不清晰目的:本研究的主要目的是对比不同饮食模式对结肠损伤的特点,探究复合饮食诱导结肠损伤的机理。方法:1.三种不同的饮食对结肠损伤的药效及机制研究3种饮食模式分别设置实验组和对照组,实验组分为3种刺激:1:高脂饮食刺激24周;2:酒精（4000 mg/kg）灌胃刺激8周;3:酒精（2000 mg/kg）+高脂饮食刺激8周,观察动物状态。检测指标主要包括:（1）动物体重,饮食情况;（2）血清生化:测定血脂相关的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和二胺氧化酶（DAO）等指标;（3）血清和结肠中的炎症因子:肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素-1β（IL-1β）的含量;（4）血清和结肠中粪臭素（skatole）,吲哚（indole）和脂多糖（LPS）含量的测定;（5）结肠的病理学检查（HE）;（6）肠道菌群;（7）结肠中TLR4,MyD88,IκBα,p50,p65,AhR,ARNT等相关蛋白的表达;（8）采用免疫组化检测结肠中p65和p50的表达。2.NCM460细胞上探究不同肠道毒素的毒性作用和协同效应采用酒精和油酸模拟动物实验中酒精+高脂饮食刺激的复合模型。考察不同浓度的单一毒素对正常或酒精+油酸诱导的NCM460细胞活性的影响,测定IC50,比较毒性,考察协同毒性和促凋亡作用,并进一步探究其分子机制。检测指标:（1）模型筛选;（2）不同毒素对正常和造模的NCM460细胞的活性影响;（3）毒性对比;（4）毒素对细胞凋亡的影响;（5）NCM460细胞中TLR4,MyD88,IκBα,p50,p65,AhR,ARNT以及核内p65和p50等相关蛋白的表达;（6）采用免疫荧光的方法测定在酒精+油酸诱导的NCM460细胞中p65和p50的蛋白表达。3.在正常动物体内验证不同混合的肠道毒素对结肠损伤的影响选取40只C57小鼠,随机分组为正常对照组（NC）,混合毒素高剂量组（MH）,混合毒素低剂量组（ML）和LPS组（LPS）。采用毒素连续腹腔注射16周,观察动物的反应和状态。检测指标:（1）动物体重（2）血清生化:TC、TG、AST、ALT和DAO含量;（3）血清的炎症因子:TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-10的含量;（4）血清和结肠中HMGB1的含量;（5）结肠的病理学检查（HE）;（6）采用免疫荧光的方法测定结肠中巨噬细胞分型,并计算M1/M2的比值。结果:1.三种不同的饮食模式对结肠损伤的药效及机制研究高脂饮食能够显著性的升高体重、血清LPS、结肠IL-1β（P<0.05）;酒精刺激8周后,体重、血清TG显著下降（P<0.01）,血清AST、ALT、DAO、结肠中TNF-α,IL-1β的含量显著上升（P<0.01）,激活NF-κB炎症通路和AhR介导的毒性物质代谢通路,升高结肠中p65和p50的表达量。在酒精+高脂的混合饮食刺激下,动物的体重显著下降,肠道屏障稳定性下降。同时血清AST、ALT和结肠中TNF-α,IL-1β含量显著上升（P<0.01）,炎症和毒性物质代谢通路分别被激活,组织中p65和p50的表达量显著升高。结果提示,高脂饮食单独刺激下,结肠组织损伤较小,但酒精能够在一定程度上诱导结肠损伤,而复合饮食刺激下,诱导严重的结肠粘膜和组织损伤。2.在细胞模型上探究不同肠道毒素的毒性作用和协同效应机制3种毒素的毒性大小依次为LPS>skatole>indole。对比发现indole的毒性作用随着时间的推移而明显上升,提示indole可能在累积复合效应下毒性作用更为明显。除skatole外,indole,LPS和混合毒素组均能显著性的升高早期凋亡细胞比例,其中混合毒素较明显。而skatole能显著性的升高细胞的晚期凋亡。同时skatole和混合毒素能够显著地激活AhR通路,增加p50在核内的表达。体外实验结果说明不同的肠道毒素具有协同损伤刺激作用,其作用可能是通过NF-κB炎症通路和AhR信号通路共同激活来实现的。3.在正常动物体内验证不同混合的肠道毒素对结肠损伤的影响毒素高剂量组（MH）和毒素低剂量组（ML）能显著地升高血清中AST和ALT的含量（P<0.01）,LPS组无明显影响,提示混合毒素能够诱导肝损伤。不同毒素可以破坏肠道的稳定性、升高血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量（P<0.01）,对比不同毒素组之间的结果发现,MH的作用最为明显,LPS组次之。对比LPS组和MH组发现,MH组在各项炎症指标上均显著高于LPS组,其中IL-1β最明显（P<0.01）。病理检查结果发现,MH组具有明显的结肠组织损伤,而ML和LPS组明显的炎性浸润。血清和结肠中HMGB1的结果显示和炎症因子相同的趋势,说明机体的炎症水平处于整体激活的状态,在此基础上,M1表达明显增加,幅度超过了M2型,提示炎症失衡是由M1型的过度活化所致。对比不同组之间的失衡状况,具有明显的量效关系。结论:混合饮食通过诱导肠道菌群紊乱,破坏肠粘膜的稳定性,同时增加肠道毒素在结肠中的蓄积,诱导结肠上皮细胞损伤,促进结肠细胞的凋亡,激活结肠中NF-κB和AhR信号通路,最终引起机体的炎症失衡,造成结肠组织炎性浸润和组织损伤。更重要的是发现了不同毒素之间存在着协同毒性效应,这一发现将有助于揭开肠道毒素和IBD之间的相互关系。本研究为后续更复杂多种毒素和结肠疾病的相关研究提供了新的思路和方向。更多还原

关 键 词： [8973699]肠道毒素 [4904442]结肠损伤 炎症 [7548698]NF-ΚB信号通路 AhR信号通路

分 类 号： [R574]

领　　域： []