导　　师： 杨世华

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 阿尔茨海默症（AD）是老年人中最常见的一种痴呆类型,并随着年龄的增长发病率越来越高,但该病的具体发病机制还不明确。临床病例显示许多痴呆患者均伴有MAPT基因的突变,尤其是P301L突变。这说明该基因在AD的发生与发展中具有重要的作用。虽然在小鼠上已展开很多关于该基因的研究,但是啮齿类动物的基因组及大脑生理结构都与人类有着巨大的差距。而非人灵长类在这些方面与人类相似,所以在非人灵长类上展开相应研究具有重要意义。本论文利用CRISPR/Cas9技术对MAPT基因进行修饰,通过构建MAPT基因修饰猴进一步研究MAPT突变所致症状与AD的相关性。首先通过软件针对MAPT基因P301位点设计1条sg RNA,并通过体外活性检测其活性。将有活性的sg RNA和Cas9 m RNA通过体外转录的方法体外合成。并制备sg RNA和Cas9 m RNA终浓度分别为50 ng/μL和100 ng/μL的载体注射液。研究内容1:研制MAPT基因敲除食蟹猴。对食蟹猴进行超数排卵,获得卵细胞,进行体外受精,在培养10～12小时之后,将上述载体混合液注入受精卵中。体外培养5天左右,对修饰胚胎进行基因型鉴定和移植。研究内容2:研究MAPT P301L定点突变食蟹猴。首先设计一段长130bp的P301L突变的ss DNA作为同源重组介导的修复模版。将sg RNA（50 ng/μL）、Cas9 m RNA（100 ng/μL）和ss DNA模板（100 ng/μL）混合,并注入食蟹猴原核期的受精卵中。体外培养5天左右,进行基因型鉴定和移植。为探索更高效的P301L点突变,在混合液的基础上进一步加入促进同源重组因子Rad51（10ng/μL）。研究内容3:对获得的MAPT基因修饰猴,提取其皮肤或组织DNA进行基因型鉴定,并对死亡的基因修饰猴进行m RNA水平的检测。对存活的MAPT基因修饰猴抽取血液,检测血浆中AD相关蛋白的表达水平。实验结果表明,该sg RNA在体外检测中可以高效的实现基因敲除,胚胎基因�

关 键 词： 研制 基因修饰 食蟹猴 表型