导　　师： 李国清; 林矫矫

授予学位： 博士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： 日本血吸虫病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。当前血吸虫病的防治主要以吡喹酮治疗为主,但存在对童虫药效差、不能预防重复感染和抗药性等问题,开发抗血吸虫疫苗并与药物联合使用可能有助于解决这些问题。当前我国血吸虫病防控已从疫情控制迈入疫情消除阶段,建立更为敏感、特异和可用于疗效考核的诊断技术,是做好血吸虫病防控工作的迫切需求。水牛和黄牛是日本血吸虫最重要的天然保虫宿主和最主要的传染源,在日本血吸虫病流行和传播中具有重要作用。众多研究表明,日本血吸虫对水牛和黄牛的易感性存在较大差异,水牛是其非适宜宿主,而黄牛是其适宜宿主,它们为日本血吸虫提供了不同的生存环境,并影响着虫体在其体内的生长发育与生存。本研究分析水牛和黄牛抗日本血吸虫感染的免疫应答差别与水牛和黄牛来源的日本血吸虫成虫蛋白质组差异;利用免疫蛋白质组学技术筛选水牛血吸虫病诊断抗原,对水牛血清特异识别的血吸虫体被蛋白分子进行鉴定分析。旨在阐明血吸虫与天然宿主相互作用的基本机制,并为其疫苗候选分子、药物靶标和诊断抗原筛选提供新思路。1.水牛和黄牛抗日本血吸虫感染的免疫应答分析。以日本血吸虫尾蚴人工感染水牛和黄牛,采集水牛和黄牛感染日本血吸虫前后的外周血,测定不同感染时期水牛和黄牛各种免疫细胞的组成与比例。结果显示,水牛组在感染日本血吸虫后CD8~+细胞比例均高于感染前,黄牛组CD4~+细胞比例在感染后显著高于感染前,并显著高于CD8~+细胞。黄牛组在感染后CD4~+/CD8~+显著升高,其比例大于1,水牛组在感染前后CD4~+/CD8~+差异不显著,其比例均小于1。水牛体内的中性粒细胞所占白细胞百分比在感染前后各个时期均低于黄牛,且在感染后各时期均显著低于感染前;单核细胞百分比在感染后各时期均显著低于黄牛组,且感染后4、6周显著低于感染前;淋巴细胞百分比在感染前后各个时期均显著高于黄牛,且在感染后各时期均显著高于感染前。黄牛组的酸性粒细胞百分比在感染后显著低于感染前,水牛组在感染后也呈下降趋势且在感染后4周显著低于感染前。红细胞和血小板指标在感染前后未发生显著变化。应用ELISA检测了水牛和黄牛感染日本血吸虫前后血清特异性抗体IgG、IgG1、IgG2、IgA和IgM变化,结果发现水牛血清特异性抗体应答比黄牛出现迟,其水平也低于黄牛。利用总NO检测试剂盒和ELISA试剂盒对水牛和黄牛感染日本血吸虫前后血清NO含量和细胞因子水平进行检测,结果发现水牛感染后各时期血清中NO含量均较感染前显著升高,且在感染后2周和4周水牛血清中的NO含量显著高于黄牛,水牛的IL-8在感染后4周和6周显著低于黄牛,IL-17在感染后4周和6周显著高于黄牛。此外,测定了不同感染时期水牛和黄牛血清肝功能相关生化指标,感染前后未见明显变化。本研究为理解水牛和黄牛抗日本血吸虫免疫应答差异提供了重要信息。2.水牛和黄牛来源日本血吸虫成虫比较蛋白质组研究。利用iTRAQ联合LC-MS/MS技术对水牛和黄牛来源的日本血吸虫成虫蛋白组差异进行了比较分析。结果显示,共鉴定到131个差异表达蛋白,与黄牛源虫体比较,PDI、GST及TSP-2等46个蛋白在水牛源的虫体中上调表达,Ribosomal protein、Tropomyosin及Myosin等85个蛋白下调表达。生物信息学分析表明差异表达蛋白主要参与蛋白合成和分解代谢、转录调控、细胞骨架以及应激反应等生命进程。本研究为理解血吸虫生长发育机制提供了实验依据,同时也可为寻找有效的疫苗候选分子和药物靶标提供基础资料。3.基于水牛血清免疫蛋白质组学的日本血吸虫病诊断抗原的筛选与评价。以日本血吸虫成虫体被蛋白为抗原,以日本血吸虫感染前、感染后8周和先用血吸虫感染再经吡喹酮治疗后4、8、14和19周的水牛血清为一抗,利用免疫蛋白质组学技术筛选潜在的血吸虫病免疫诊断抗原。结果显示,6个蛋白点未被血吸虫感染前水牛血清识别,在感染后8周呈阳性,吡喹酮治疗后又陆续转为阴性。经质谱鉴定这6个蛋白点分属于4种不同蛋白。从中挑选亲环蛋白A(cyclophilin A)进行了克隆、表达,ELISA法分析结果显示,在日本血吸虫感染后8周,3头水牛体内均出现较高水平的抗rSjCyPA和SEA特异性抗体;以r SjCyPA为检测抗原,在吡喹酮治疗后8周3头水牛都陆续转为阴性;而以目前最常用的日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA为检测抗原,一直到治疗后19周均未转阴。结果表明,以r Sj CyPA作为诊断抗原的疗效考核效果要优于常用的SEA抗原。进一步应用ELISA法检测了114份日本血吸虫感染的水牛血清和86份健康水牛血清,结果显示以r SjCyPA和SEA作为诊断抗原,其敏感性分别为79.82%和100.00%,特异性分别为95.35%和67.41%。而在检测14份前后盘吸虫感染水牛血清时,rSjCyPA的交叉反应率为14.29%,SEA为71.43%。结果表明以rSjCyPA作为水牛血吸虫病的诊断抗原具有潜在的应用价值。4.水牛血清特异识别的日本血吸虫体被抗原分子鉴定与分析。应用免疫蛋白质组学技术,利用日本血吸虫感染前和感染后8周水牛与黄牛血清,分别对日本血吸虫成虫体被蛋白进行免疫筛选。其中黄牛和水牛阴性血清识别的蛋白点分别为83和108个,而黄牛和水牛感染后8周血清识别的蛋白点分别有86和138个,对这些蛋白点进行比较分析并与制备胶匹配挑点后,挑取19个水牛血清特异识别的蛋白点进行质谱分析,成功鉴定了13个蛋白点,代表PGM、CyPA及FABP等10种蛋白。对鉴定的蛋白进行生物信息学分析,结果显示这些蛋白主要与细胞骨架构成、能量代谢以及蛋白折叠有关。本研究为更好理解血吸虫与宿主之间的相互作用关系以及疫苗候选分子的鉴定提供了重要信息。更多还原

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分 类 号： [S852.735]

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