导　　师： 王斌

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 猪圆环病毒2型(PCV2)是引起高致死断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内给养猪业造成了重大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是该病毒主要结构和功能蛋白,由猪圆环病毒2型基因的ORF2编码合成。本论文利用大肠杆菌,毕赤酵母和黑曲霉3种不同的表达系统对PCV2-Cap进行表达研究,为PCV2亚单位疫苗的开发提供数据支持。Ⅰ PCV2-Cap在大肠杆菌中的重组表达及优化根据GeneBank公布的PCV2全基因组序列(DQ104422.1),经过密码子优化后人工合成PCV2-Cap基因。将PCV2-Cap基因去除核定位信号后插入pET-28a(+)载体中转入大肠杆菌BL21菌株中表达,经IPTG诱导,实现了猪圆环病毒2型Cap蛋白的胞外表达。亲和层析结果表明在60%buffer B条件下洗脱可以获得较高程度的纯化。对重组的PCV2-Cap蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示重组蛋白可以与一抗Anti-PCV2 Cap蛋白发生特异性的结合。Ⅱ PCV2-Cap在毕赤酵母中的分泌表达、小试发酵及重组蛋白的动物免疫试验将密码子优化的PCV2-Cap基因插入pPICZαA表达载体中,转化毕赤酵母X-33宿主,通过PCR鉴定基因组的方法筛选获得高效表达的菌株,摇瓶发酵上清中检测到了分泌表达的PCV2-Cap蛋白。在5L发酵罐中进行高密度发酵小试,发酵液上清中PCV2-Cap蛋白的产量达到了0.53 mg/m L的水平,占总蛋白定量比例的23.5%。在仔猪模型上进行了PCV2-Cap蛋白免疫抗原的体内免疫实验,重组Cap蛋白能够在动物体内刺激特异性抗体的产生。结果表明PCV2-Cap蛋白在毕赤酵母中实现了分泌表达并具有良好的免疫原性,且核定位信号的缺失不影响PCV2-Cap蛋白的免疫性能。Ⅲ PCV2-Cap在黑曲霉中的融合表达采用融合表达的策略,将PCV2-Cap基因经密码子优化后,与gla A基因N端编码糖化酶蛋白质催化域的基因序列融合,插入到pMD18-pyr G-TglaA通用表达载体中,通过同

关 键 词： 猪圆环病毒 型 蛋白 大肠杆菌 毕赤酵母 黑曲霉 重组表达

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