导　　师： 王声斌;陈权军

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南农业大学

摘　　要： α-酮戊二酸是一种重要的短链羧酸，在食品、医药和化妆品等行业有广泛的应用。在顺乌头酸酶（aconitase，ACO，EC4.2.1.3）的作用下，柠檬酸可以通过脱水与加水反应生成异柠檬酸，异柠檬酸又可在异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH，EC1.1.1.42）的催化作用下，氧化脱羧生成α-酮戊二酸及CO2，同时将辅酶NADP+转变成其还原形式NADPH。柠檬酸来源丰富、价格低廉，ACO和IDH复合物组装的共固定化，为α-酮戊二酸的生产探索了一条新途径。本实验以ACO和IDH为研究对象，分别将大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的ACO和IDH基因在大肠杆菌中进行表达、纯化，对IDH进行酶活性和动力学参数的测定，为ACO和IDH的定向、共价固定化奠定了基础。　　本实验以ACO和IDH作为固定化研究的目的蛋白，将大肠杆菌的ACO基因acnA、acnB与IDH基因icd1，以及枯草芽孢杆菌的ACO基因cit B和IDH基因icd2分别融合了His标签和可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（Sfp）修饰的短肽SRP标签，成功构建了pET30a-His-SRP-acnA、pET28b-His-SRP-acnB、pET28b-His-SRP-icd1、pET28b-His-SRP-citB、pET28b-His-SRP-icd2五个重组表达载体，表达和纯化出目的蛋白，并将其分别命名为ACO1、ACO2、IDH1、ACO3、IDH2。同时对IDH1和IDH2进行了酶活性和动力学参数测定，经过多次重复实验，结果显示，IDH1和ID H2的活性分别为36.40U、30.23U，Km值分别为0.14mM和0.05mM，Kcat值分别为152.84 s-1和111.06 s-1，因此在底物充足时，IDH1比IDH2的催化效率高。　　在此基础上，本实验选择一个与特定DNA结合能力强、长度为243bp的锌指结构域基因zif，将其与大肠杆菌icd1融合，构建了pET30a-zif-TEV(RS)-icd1-SRP-His、pET28b-His-SRP-icd1-TEV(RS)-zif两个表达载体，进行诱导表达和纯化，并将两种酶分别命名为IDH3和IDH4。此外，对IDH3和IDH4的酶动力学参数的测定的结果显示，IDH3和IDH4�

关 键 词： 顺乌头酸酶 异柠檬酸脱氢酶 共价固定化 大肠杆菌 重组表达 酶活性

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