导　　师： 陈云波

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 目的:1.通过熏烟联合脂多糖(LPS)建立小鼠气道炎症模型,并灌胃给予健脾益肺II号(JPYF II)进行药物干预,明确JPYF II对熏烟联合LPS诱导的气道炎症的作用并揭示JYII对抑制肺组织炎症的机制。2.在体外实验中,明确JYII对香烟提取物(CSE)诱导巨噬细胞系RAW264.7炎症因子表达及NF-κB信号通路的影响,补充说明JYII抑制香烟诱导的巨噬细胞炎症因子的表达的作用及机制。方法:体内实验1.分组与处理:选取SPF级雌性Balb/c小鼠48只,随机分成6组:分别为正常对照组,模型组,健脾益肺II号低剂量组(0.75g/kg),健脾益肺II号中剂量组(1.5g/kg),健脾益肺II号高剂量组(3g/kg),地塞米松组(2mg/kg),每组8只。(由于用于病理性检测的肺组织不能进行支气管灌洗,因此需进行重复实验)在重复实验中我们选取SPF级雌性Balb/c小鼠60只,分组相同,每组10只。采用香烟熏烟联合脂多糖的方法建立炎症小鼠模型。模型组,第1、14天气管内滴注脂多糖(LPS)10ug/只,第2-13天及15-30天进行熏烟处理,3次/天,每次3支香烟,烟雾用60ml注射器注入熏烟箱中。于9am,12am,3pm进行,每次1h,第31天取材。用药组,造模方法同模型组,从第17天开始进行药物干预,给药2周。正常对照组,标准饲养30天,不做任何干预,第17天开始给与纯水灌胃2周。2.基本情况及病理观察:记录小鼠的体重变化情况;进行支气管灌洗液中细胞总数及分类计数和通过HE染色法对肺组织病理形态学进行评价。3.肺组织炎症因子检测:采用Realtime PCR方法检测模型小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNFα和金属蛋白酶MMP9、MMP12 mRNA的表达情况。4.氧化应激检测:应用MDA、GSH、CAT、GSH-Px试剂盒分别测定肺组织中MDA和GSH的含量以及CAT和GSH-Px活性。5.NF-κB信号通路激活的检测:Western blot方法检测肺组织p65、p-p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达。体外实验6.体外细胞模型的建立及干预:体外实验选用RAW264.7细胞,实验分五组,分别为正常对照组,模型组,健脾益肺II号低剂量组(12.5ug/ml),健脾益肺II号中剂量组(25ug/ml),健脾益肺II号高剂量组(50ug/ml)和地塞米松组。利用香烟烟雾提取物(CSE)刺激RAW264.7细胞建立炎症巨噬细胞模型,CSE刺激3小时后随即进行健脾益肺II号及地塞米松药物干预。对照组不做干预处理。7.细胞因子检测:采用Realtime PCR方法检测模型RAW264.7细胞中炎症因子IL-1β、IL-6和TNFαmRNA的表达情况。8.NF-κB信号通路激活的检测:Western blot方法检测不同处理组RAW264.7细胞内p65、p-p65、IκBα、p-IκBα蛋白表达。9.采用SPSS19.0统计软件包进行数据分析。不同组间用one-way ANOVA进行方差分析,以p<0.05为差异有统计学意义,实验数据均以均数±标准差表示。结果:1.健脾益肺II号对熏烟联合LPS诱导的气道炎症的影响1.1健脾益肺II号对熏烟联合LPS诱导的气道炎症小鼠体重的影响与实验前相比,正常组小鼠体重有明显的上升趋势,模型组小鼠体重比熏烟前有明显的下降趋势,应用JPYF II后,对小鼠体重并没有影响,其体重变化趋势跟模型组变化趋势相似。1.2健脾益肺II号对熏烟联合LPS诱导的气道炎症小鼠气道灌洗液(BALF)细胞总数及细胞组成变化的影响研究结果显示,模型组气道灌洗液中细胞总数升高,且与正常组相比有统计学差异(p<0.01),JPYF II中、高剂量组、地塞米松组与模型组相比明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),说明了JPYF II对熏烟联合LPS诱导的小鼠气道炎症反应有明显的抑制作用。在细胞分类计数中,模型组单核巨噬细胞、中性粒细胞以及淋巴细胞与正常组相比明显增加(p<0.01);JPYF II中、高剂量组和地塞米松组均能明显降低熏烟联合LPS诱导的炎症小鼠气道单核巨噬细胞和中性粒细胞数(p<0.01),但未改变淋巴细胞计数(p>0.05);JPYF II低剂量组未能降低熏烟联合LPS诱导的小鼠气道炎症细胞数(p>0.05)。1.3健脾益肺II号对熏烟联合LPS诱导的肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA水平表达的影响Real-time PCR法检测肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA水平,结果发现,与正常组小鼠相比,模型组小鼠炎症因子IL-1β、TNFa mRNA水平明显上调(p<0.01),IL-6 mRNA水平没有改变(p>0.05)。JPYF II低、中、高剂量组均能明显下调熏烟联合LPS诱导的炎症小鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNFa mRNA水平。地塞米松对熏烟联合LPS诱导的炎症小鼠肺组织炎症因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA水平的表达也有明显下调作用。1.4健脾益肺II号对肺组织中金属蛋白酶MMP9、MMP12 mRNA水平表达的影响PCR法检测肺组织中金属蛋白酶MMP9、MMP12 mRNA水平,实验结果显示,与正常组小鼠相比,模型组小鼠金属蛋白酶MMP12 mRNA水平明显上调(p<0.01),MMP9 mRNA水平也有上调趋势但差异没有统计学意义。健脾益肺II号低、中、高剂量组均能明显下调熏烟联合LPS诱导的炎症小鼠金属蛋白酶MMP9、MMP12 mRNA水平。其中,中高剂量组作用效果最为明显,低剂量组稍弱。地塞米松对熏烟和LPS联合诱导的炎症小鼠肺组织金属蛋白酶表达的也具有明显下调作用。1.5健脾益肺II号对肺组织氧化应激的影响选取MDA、GSH、GSH-Px、CAT 4个指标评估健脾益肺II号对肺组织氧化应激的影响,实验结果显示:与正常组小鼠相比,模型组小鼠肺组织CAT和GSH-Px活性明显降低(p<0.01),MDA和GSH含量明显增加(p<0.01);与模型组相比,JPYF II低剂量组小鼠CAT活性变化差异无统计学意义(p>0.05),中、高剂量组小鼠CAT活性明显增加(p<0.001);JPYF II不同剂量组均能降低模型小鼠肺组织MDA含量(p<0.05);JPYF II低、中、高剂量组均能提高模型小鼠肺组织GSH-Px活性(p<0.05),并且JPYF II中、高剂量组明显降低模型小鼠肺组织GSH的含量(p<0.001),但其低剂量组对模型小鼠肺组织GSH的含量没有产生明显影响(p>0.05)。同时,地塞米松也能增加模型小鼠肺组织CAT及GSH-Px活性(p<0.05),但对模型小鼠肺组织MDA和GSH含量没有明显的改善作用(p>0.05)。1.6健脾益肺II号对肺组织形态学的影响肺组织经HE染色后,镜下观察显示,正常组小鼠气管可见少量炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,肺泡组织形态均匀,结构完整,肺泡区炎症细胞浸润较少。模型组小鼠小支气管狭窄,管腔狭小甚至在终末部分可萎缩;粘膜下,各级支气管壁及其周围细胞间质有大量炎性细胞浸润;肺泡腔扩大,肺泡数目显著减少,部分肺泡破裂融合。干预组使各级支气管壁、血管粘膜下和周围肺组织炎性细胞浸润减轻,肺泡破坏数目减少。其中中、高剂量组改善更明显些。1.7健脾益肺II号对熏烟联合脂多糖诱导的小鼠肺组织NF-kB信号通路的影响体内Western Blot结果显示:与正常组相比,模型组p-IκBα和p-p65的表达明显上升(p<0.05)。与模型组相比,JPYF II不同剂量都能明显抑制IκBα的磷酸化(p<0.001);JPYF II低高剂量组能抑制模型小鼠肺组织p65蛋白磷酸化(p<0.05),其中剂量组模型小鼠肺组p65蛋白磷酸化未产生明显影响(p>0.05)。地塞米松对模型小鼠肺组IκBα的磷酸化及p65蛋白磷酸化也有抑制作用(p<0.05)。2健脾益肺II号对CSE诱导巨噬细胞炎症因子表达及机制2.1健脾益肺II号对CSE诱导RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA水平表达的影响Real-time PCR法检测细胞内炎症因子IL-1β、IL-6、TNFαmRNA水平,结果发现,与正常组相比,CSE诱导的RAW264.7细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNFa mRNA表达明显上调(p<0.001)。与模型组相比,JPYF II高剂量组均能明显下调炎症因子IL-1βmRNA的表达(p<0.05),其低、中剂量组对炎症因子IL-1βmRNA的表达没有明显影响(p>0.05);JPYF II低、中、高剂量组均能明显下调模型组细胞内炎症因子IL-6 mRNA的表达(p<0.001);JPYF II中、高剂量组均能明显下调模型组细胞内炎症因子TNFa mRNA的表达(p<0.05),其低剂量组对模型组细胞内炎症因子TNFa mRNA的表达没有明显影响(p>0.05)。地塞米松对CSE诱导的巨噬细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNFamRNA的表达水平也具有显著的下调作用(p<0.01)。2.2健脾益肺II号对CSE刺激的RAW264.7细胞系NFkB信号通路的影响体外Western Blot结果显示:与正常组相比,模型组p-IκBα和p-p65的表达明显上升(p<0.05)。与模型组相比,JPYF II不同剂量都能明显抑制IκBα的磷酸化(p<0.001);JPYF II低中剂量组能抑制CSE刺激的RAW264.7细胞p65蛋白磷酸化(p<0.05),其高剂量组对CSE刺激的RAW264.7细胞p65蛋白磷酸化未产生明显影响(p>0.05)。地塞米松对CSE刺激的RAW264.7细胞IκBα的磷酸化及p65蛋白磷酸化也有抑制作用(p<0.05)结论:1.通过熏烟1个月联合气管滴注LPS可成功诱导出小鼠肺部炎症,增加气道巨噬细胞,中性粒细胞和淋巴细胞数量,通过激活NF-κB等信号通路,增加肺组织炎症因子如IL-1β、IL-6、TNFα以及金属蛋白酶MMP9和MMP12等的表达,增加氧化应激产物MDA和GSH水平,降低过氧化氢酶CAT及GPx活性造成组织损伤。2.健脾益肺II号可以减轻熏烟联合LPS诱导的小鼠气道中性粒细胞和巨噬细胞的浸润,减少肺组织氧化应激损伤、和炎症因子表达,说明了本方具有抑制气道免疫反应,抗氧化应激、抗炎的作用。中剂量和高剂量表现更明显。3.健脾益肺II号具有抑制肺组织和巨噬细胞NF-κB信号通路的作用,并可能通过抑制NF-κB信号通路,减轻肺组织及巨噬细胞炎症因子的表达。更多还原

关 键 词： COPD 健脾益肺II号 [5195336]抗炎 抗氧化

分 类 号： [R285.5]

领　　域： []