导　　师： 林影

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 肌酐是人体肌肉中的磷酸肌酸通过自发的且不可逆转的过程形成的,在肾脏功能正常情况下,肌酐在血液中的浓度维持在一个较低的水平,而肾脏功能不全时,会导致肌酐在血清中的积累,血清中肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。对于肌酐的检测,应用最为广泛的是碱性苦味酸法,但存在的着反应特异性差与灵敏度有限的问题,目前正逐渐被酶法（肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法）检测所替代,其中肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶是三个关键性的酶,肌酐酶可逆地水解肌酐生成肌酸,肌酸酶催化肌酸水解产生肌氨酸和尿素,肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下水解生成甲醛、甘氨酸和H2O2,偶联Trinder氏反应,通过比色测定,计算出样品中肌酐的含量。酶法具有抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、灵敏度高等特点,商品化的试剂盒大多采用肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法,在临床上得到了越来越多的使用。本课题从基因库查找到了来源于恶臭假单胞菌的肌酐酶,密码子优化后全合成基因,利用大肠杆菌和毕赤酵母作为表达宿主菌,成功实现了肌酐酶的外源表达;克隆了来源于烟草节杆菌23710的肌酸酶基因,另外全基因合成获得大肠杆菌密码子优化的来源于芽孢杆菌BSD-8的肌氨酸氧化酶基因,利用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达宿主菌,分别实现了肌酸酶和肌氨酸氧化酶的外源表达。本课题的主要研究内容及结果如下:全基因合成获得大肠杆菌密码子优化的恶臭假单胞菌肌酐酶cine-c,通过PCR进行扩增,构建重组质粒pET28a/cine-c并转入大肠杆菌BL21（DE3）中,筛选出重组大肠杆菌B/pET28a-cine-c。在TB培养基中进行发酵,以IPTG诱导产酶。重组肌酐酶Cine-c的比酶活为489.2U/mg,最适反应温度为60℃,最适反应pH为7.0,在50℃时酶稳定性较好,保温3h后依然维持80%的酶活力,在pH7.0-9.0条件下比较稳定,Cu2+,Mn2+、Z

关 键 词： 肌酐酶 肌酸酶 肌氨酸氧化酶 外源表达 纯化 酶学性质

领　　域： []