导　　师： 陈宏

授予学位： 博士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 目的：　　构建靶向COX2-shRNA慢病毒载体，观察COX-2shRNA对肝星状细胞衰老的影响，探讨其对肝纤维化的抑制作用及机制。　　方法：　　1.构建3条COX-2shRNA序列至慢病毒载体GV248中，感染大鼠HSC-T6细胞株，通过实时荧光定量PCR技术筛选出干扰效率最高的COX-2shRNA序列。　　2.将干扰效率最高的COX-2shRNA慢病毒载体，通过尾静脉注射到高脂-CCL4诱导的肝纤维化模型大鼠中。12周末，处死大鼠。油红“O”染色（冰冻切片）、HE染色和Masson染色分析肝组织脂肪变性及纤维病变程度;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;实时荧光定量PCR检测肝组织匀浆COX-2mRNA、α-SMAmRNA、p53mRNA的表达。同时检测血清总胆固醇、甘油三酯、谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量。　　3.以大鼠HSC-T6细胞株为研究对象，应用PFT-α抑制p53活性来研究p53通路在COX-2shRNA诱导HSC-T6衰老中的作用。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老，CCK8检测细胞增殖，流式细胞仪测定细胞周期，q-PCR检测p53mRNA及p21mRNA的表达。　　结果：　　1.通过qPCR对3条序列慢病毒干扰效率的筛选发现，COX-2-shRNA-1、COX-2-shRNA-2和COX-2-shRNA-3组分别与正常对照组相比，COX-2的表达均下降84.7％、86.3％和91.8％。　　2.动物实验研究表明：(1)HE染色显示，COX-2shRNA组与肝纤维化模型组相比，肝脂肪变性减轻。(2)油红“O”染色显示，COX-2shRNA组与肝纤维化模型组相比，大鼠肝组织脂变面积明显减少，差异有显著性(P＜0.01)。(3)Masson染色显示，COX2shRNA组与肝纤维化模型组相比，大鼠肝组织胶原面积明显减少，差异有显著性(P＜0.01)。(4)肝功能结果显示，与肝纤维化模型组比较，COX-2shRNA组大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平均下降，差异有显著性（P＜0.05）。(5)Q-PCR检测结果显示，与肝纤维化模型组大鼠比较，COX-2shRNA组大鼠肝脏组织中α-SMAmRNA、COX-2mRNA表�

关 键 词： 肝纤维化 慢病毒载体 细胞衰老 抑制机制

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