导　　师： 崔堂兵

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： β-甘露聚糖酶为一种半纤维素酶,可以将含有β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键的甘露聚糖水解,并释放出低聚甘露糖。β-甘露聚糖酶在石油与天然气的开采、造纸、饲料、食品、制药等诸多领域有着广泛的应用,需求量也在不断的增加。因而,筛选出能够高产β-甘露聚糖酶的野生菌株对于β-甘露聚糖的开发应用以及构建基因工程菌有十分重要的意义。本研究以采集到的土壤为实验样品,旨在筛选分离到β-甘露聚糖酶产生菌株,并对产酶最佳的菌株进行种属鉴定,克隆并表达出筛选得到的野生菌株中的β-甘露聚糖酶基因,对重组β-甘露聚糖酶纯化后进行酶学性质研究,主要得到如下研究结果:1.通过初筛(魔芋粉为唯一碳源并结合刚果红染色法)和复筛(用DNS法测定β-甘露聚糖酶活力)的方法,从河南省信阳市采集的森林土壤中筛选产β-甘露糖苷酶的菌株,筛选获得1株具有高产β-甘露糖苷酶的菌株B19(比酶活为149.3U/mg)。通过观察菌株形态观察、革兰氏染色、生理生化实验、16S rDNA序列分析和构建系统发育进化树等方法,确定了该菌株是肠杆菌属中的Enterobacter bugandensis,并命名为Enterobacter bugandensis B19,GenBanK登录号为KU500561。2.通过生物信息学的方法,对来源于肠杆菌属的β-甘露聚糖酶序列进行比对分析设计引物,采用PCR扩增技术从Enterobacter bugandensis B19中扩增出β-甘露聚糖酶的基因片段(manB19)。该manB19基因全长为1047 bp,编码348个氨基酸,预测蛋白分子量为38.6 kDa。根据氨基酸序列比较结果,该氨基酸序列与已报道的来源于Pantoea agglomerans strain A021(GenBank No.ACN30272)的β-甘露聚糖酶氨基酸序列的相似性高达98%,属于糖苷水解酶GH26家族的小分子甘露聚糖酶。将manB19基因克隆到载体pET-28a(+)中,构建表达载体pET-28a(+)-manB19,实现了Enterobacter bugandensis B19的β-甘露聚糖基因manB19在E.coli BL21(DE3)表达

关 键 词： 甘露聚糖酶 筛选及鉴定 克隆与表达 酶学性质

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