导　　师： 张天奉

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 研究一食源性肥胖SD大鼠2型糖尿病模型的实验研究背景:高脂饮食喂养联合注射小剂量链脲佐菌素(STZ)是实验性2型糖尿病模型最常用的的造模方法,该方法已被广泛应用于2型糖尿病及2型糖尿病肾病的研究中。研究发现,高脂饮食喂养可诱导部分动物形成食源性肥胖模型。食源性肥胖动物模型具有明显的胰岛素抵抗特征,利用该模型注射小剂量STZ形成2型糖尿病模型的成功率比常规造模方法明显提高。但是,高脂饮食仅能诱导大约50%的动物产生食源性肥胖,因此需探讨如何提高食源性肥胖成模率。同时,STZ的注射剂量与2型糖尿病成模率直接相关,但是目前尚无统一的STZ注射量标准,因此仍需继续探讨STZ的注射剂量。目的:通过观察给予不同高脂饮食配方后大鼠的食源性肥胖成模情况,寻求建立食源性肥胖大鼠模型较佳的造模方式;在食源性肥胖大鼠模型的基础上探讨不同STZ剂量对建立2型糖尿病大鼠模型的影响,为制备2型糖尿病大鼠模型提供参考依据。方法:本实验分为两大步骤,第一步先制造食源性肥胖大鼠模型,第二步在食源性肥胖大鼠模型的基础上注射小剂量STZ制造2型糖尿病大鼠模型。第一步:雄性SD大鼠随机分为空白组、高脂高糖饲料组和三联法组。空白组给予普通饲料喂养,高脂高糖饲料组给予高脂高糖饲料喂养,三联法组给予高脂高糖饲料自由进食+高脂乳制灌胃+蔗糖水自由饮用。高脂高糖喂养第6周末称量体重,若体重≥空白组体重均值+2倍标准差者为食源性肥胖大鼠,纳入食源性肥胖大鼠,其余不达标者淘汰。纳入食源性肥胖大鼠后,称量大鼠体重并用代谢笼收集和计算各组大鼠一天的进食量、饮水量和尿量。第二步:各组大鼠禁食12小时后,按照注射剂量不同,将食源性肥胖大鼠随机分为A组(原高脂高糖饲料组,STZ 26mg/kg)、B组(原高脂高糖饲料组,STZ 28mg/kg)、C组(原高脂高糖饲料组,STZ 30mg/kg)、D组(原三联法组,STZ 26mg/kg)、E组(原三联法组,STZ 28mg/kg)、F组(原三联法组,STZ 30mg/kg),空白组腹腔注射同等剂量柠檬酸钠缓冲液。各组于注射STZ后7天、14天、21天、28天经尾静脉采血测空腹血糖,连续4次空腹血糖≥11.lmmol/L者为2型糖尿病大鼠。纳入2型糖尿病大鼠后,称量大鼠体重并用代谢笼收集和计算各组大鼠一天的进食量、饮水量和尿量。注射STZ后第31天取材,采血检测空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯和胰岛素,并取部分胰腺组织进行HE染色。结果:(1)经过6周的高脂高糖饮食后,三联法组食源性肥胖的成模率(81.25%)明显高于高脂高糖饲料组的成模率(47.92%),有显著性差异(P<0.05)。(2)注射STZ 4周后,A～F组与自身注射STZ前比较,进食量、饮水量、尿量均明显升高,有显著性差异(P<0.05),体重明显下降,有显著性差异(P<0.05),出现明显的“三多一少”现象。(3)注射STZ后第31天,与空白组相比,A～F组的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、胰岛素抵抗指数均明显升高,有显著性差异(P<0.05)。(4)注射STZ后第31天,与空白组相比,A～F组的胰腺组织HE染色可见胰岛组织明显萎缩,胰岛数量与细胞数减少,部分胰岛细胞内出现脂质沉积等病理改变。(5)注射STZ后的31天内,C组和F组(STZ 30mg/kg剂量组)有动物死亡,但是A～F组存活率没有显著差异(P>0.05);E组(STZ 28mg/kg剂量组)的2型糖尿病成模率高于D组(STZ 26mg/kg剂量组),有显著性差异(P<0.05)。结论:(1)连续6周三联法喂养是建立食源性肥胖大鼠模型的较佳方法。(2)连续6周三联法喂养联合一次性腹腔注射STZ 28mg/kg是建立2型糖尿病模型的较佳方法。研究二 理中汤抑制2型糖尿病大鼠肾脏纤维化的作用和机制研究背景:糖尿病是最常见的代谢性疾病,其发病类型以2型糖尿病为主。糖尿病肾病是糖尿病主要的慢性微血管并发症之一,也是导致终末期肾病的主要原因之一。研究报道,约有20%～30%的2型糖尿病患者会发生糖尿病肾病,随着2型糖尿病的发病率升高,糖尿病肾病的发病率也逐渐升高,严重影响患者的生存质量。西方医学中的“糖尿病”与中医学中的“消渴”相类似。中医药治疗消渴源远流长,积累了许多经验。总结古今治疗消渴的用药经验,可以发现“气虚”是贯穿消渴始终的基本病机。同时,从“治未病”角度出发,治疗消渴肾病应当先温阳健脾,补后天以养先天。因此,我们认为治疗早期消渴肾病宜采用“益气温阳健脾”疗法。理中汤是临床治疗糖尿病及其并发症的常用方,具有温中祛寒、益气健脾之功,故针对早期消渴肾病可选用理中汤治疗。但是目前关于理中汤对2型糖尿病肾病的研究较少,有待进一步深入探讨和研究。目的:通过观察理中汤对2型糖尿病大鼠一般情况、肾重指数、肾功能、肾组织形态、肾皮质VEGFA、TGF-β 1、COL-1蛋白表达和miR-200b基因表达的影响,证实理中汤对2型糖尿病大鼠肾脏有抗纤维化作用并初步探讨其机制所在。方法:将雄性SD大鼠随机分为空白组和造模组。空白组给予普通饲料和动物房饮用水喂养,造模组给予高脂高糖饲料自由进食+高脂乳制灌胃+蔗糖水自由饮用三联法喂养,连续喂养6周后称量体重,若体重≥空白组体重均值+2倍标准差者为食源性肥胖大鼠,纳入食源性肥胖大鼠,其余全部淘汰。纳入食源性肥胖大鼠后,造模组停止高脂高糖乳制和蔗糖水喂养,改为高脂高糖饲料和动物房饮用水喂养,直至实验结束。然后对纳入的食源性肥胖大鼠一次性腹腔注射1%STZ 28mg/kg,空白组腹腔注射同等剂量柠檬酸钠缓冲液。造模组于注射STZ后7天、14天、21天、28天经尾静脉采血测空腹血糖,连续4次空腹血糖≥11.1mmmol/L,且伴有多饮、多食、多尿现象者确定为2型糖尿病大鼠。然后将2型糖尿病大鼠随机分为模型组、氯沙坦钾组和理中汤组3组。氯沙坦钾组给予氯沙坦钾灌胃,理中汤组给予理中汤灌胃,空白组和模型组给予同等体积蒸馏水灌胃,连续干预12周。干预12周末用代谢笼收集大鼠24小时尿液并记录尿量,检测24h尿微量白蛋白。干预12周后取材,采血检测空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、尿素氮、血肌酐、糖化血红蛋白和空腹胰岛素,并计算胰岛素抵抗指数:称量体重与双肾重量,计算肾脏重量指数(肾重/体重);取部分肾皮质组织用于HE、PAS、PASM、MASSON染色和电镜标本制作,并利用软件分别计算PAS、PASM、MASSON染色的阳性染色面积百分比;取部分肾皮质组织检测VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表达水平和miR-200b基因表达水平。结果:(1)干预0周、4周、8周、12周时,与空白组比较,各组的体重均下降(P<0.05);与模型组相比,理中汤组和氯沙坦钾组的体重无显著性改变(P>0.05)。(2)干预12周后,与空白组比较,各组的肾脏重量指数显著升高(P<0.05);与模型组比较,理中汤组和氯沙坦钾组的肾脏重量指数明显降低(P<0.05),但两组间比较无明显差异(P>0.05)。(3)干预12周后,与空白组相比,各组的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、肌酐、尿素氮、胰岛素抵抗指数、糖化血红蛋白和尿微量白蛋白均显著升高(P<0.05);与模型组相比,理中汤组能降低血糖、总胆固醇、甘油三酯、胰岛素抵抗指数和糖化血红蛋白(P<0.05),而氯沙坦钾组无显著性改变(P>0.05)。干预12周后,与模型组相比,理中汤组和氯沙坦钾组均可以明显降低肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白(P<0.05),但两组间比较无明显差异(P>0.05)。(4)干预12周后,染色和电镜结果可见理中汤组和氯沙坦钾组的病理变化较模型组明显减轻;与模型组比较,理中汤组和氯沙坦钾组PAS、PASM、MASSON染色阳性率均降低,有显著性差异(P<0.05)。(5)干预12周后,与空白组比较,各组的VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,理中汤组和氯沙坦钾组的VEGFA、TGF-β 1、COL-I蛋白表达明显降低(P<0.05),但理中汤组和氯沙坦钾组两组间比较无明显差异(P>0.05)。(6)干预12周后,与空白组比较,各组的miR-200b基因表达量明显降低(P<0.05);与模型组比较,理中汤组和氯氯沙坦钾组miR-200b基因表达量明显升高(P<0.05),但是理中汤组和氯氯沙坦钾组两组间的miR-200b基因表达量无明显差异(P>0.05)。结论:(1)理中汤可以改善2型糖尿病大鼠糖脂代谢和肾功能;(2)理中汤可以改善2型糖尿病大鼠肾脏病理学变化,抑制纤维化进展;(3)理中汤对2型糖尿病大鼠肾脏的抗纤维化作用可能与降糖、调节脂代谢和调控 TGF-β 1/miR-200b/VEGFA 通路有关。更多还原

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