导　　师： 杨洪艳

授予学位： 博士

作　　者： (）;

机构地区： 广州中医药大学

摘　　要： 目的:采用去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclonhexene diepoxide,VCD)诱导的早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency,POI)小鼠模型,探讨护阳养坤方通过调节TAK1-TGF-β通路改善卵巢微环境促进胚胎胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)移植重建并恢复卵巢功能的作用的机制。方法:实验一:将16只C57B/L6小鼠随机分为对照组(CON)和模型组(MOD),每组8只。以160 mg·kg-1的剂量对模型组进行连续共15天的VCD芝麻油溶液腹腔注射建立小鼠POI模型,对照组给与等量芝麻油腹腔注射,第50-55天根据小鼠当天动情周期情况,选择动情间期取材。实验通过采集阴道脱落细胞涂片监测动情周期变化,并对卵巢组织切片进行HE染色后计数各级卵泡数目,进行比较分析,判断造模是否成功。实验二:将雌性C57B/L6小鼠共100只,随机分为对照组(CON)、模型组(MOD)、护阳养坤方组(HY)、干细胞组(SC)和干细胞联合中药组(SCHY),每组20只。对照组(CON)于实验第1天(D1)起持续腹腔注射与VCD芝麻油溶液等体积的芝麻油15天,每天1次;实验第1天(D1)起持续灌胃与护阳养坤方药液等体积的生理盐水直至取材。模型组(MOD)于实验第1天(D1)起持续腹腔注射VCD芝麻油溶液15天,每天1次;实验第1天(D1)起持续灌胃与护阳养坤方药液等体积的生理盐水直至取材。护阳养坤方组(HY)于实验第1天(D1)起持续腹腔注射与VCD芝麻油溶液15天,每天1次;实验第1天(D1)起持续灌胃护阳养坤方药液直至取材。干细胞组(SC)于实验第1天(D1)起持续腹腔注射VCD芝麻油溶液15天,每天1次;实验第1天(D1)起持续灌胃与护阳养坤方药液等体积的生理盐水直至取材;造模后10天(D25),经尾静脉注射小鼠胚胎干细胞悬液1次。干细胞联合护阳养坤方组(SCHY)于实验第1天(D1)起持续腹腔注射VCD芝麻油溶液15天,每天1次;实验第1天(D1)起持续灌胃护阳养坤方药液直至取材;造模后10天(D25),经尾静脉注射小鼠胚胎干细胞悬液1次。通过阴道脱落细胞涂片监测小鼠动情周期,称量小鼠体重及卵巢和子宫重量计算脏器指数,制备肝、肾组织的病理切片进行HE染色后观察判断干预措施对肝肾的影响,通过卵巢组织HE染色病理切片计数各级卵泡数目,并通过ELISA法检测小鼠血清性激素FSH、AMH、E2的水平。实验三:在实验二中取材得到对照组、模型组、护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组小鼠的卵巢组织。对部分卵巢组织进行病理切片和免疫组化染色,并在光镜下观察各组间 TNF-α、IL6、FSHR、PR、ER、TGF-β、BMP4、TAK1、Smad4和JNK的蛋白表达,并拍片进行定量分析。对部分卵巢组织分别进行miRNA和mRNA的提取,设计引物并通过RT-qPCR的方法对miR143、miR145、miR135、miR429以及 TAKI、TARF6、TAB1、TAB2、Smad4、Smad2、Smad3、MKK6、P38 和 JNK 基因 mRNA进行荧光定量检测。留取部分卵巢组织提取总蛋白,进行Western-Blot检测卵巢中TGF-β、Smad4和FSHR蛋白的表达。综合各项指标结果研讨护阳养坤方联合干细胞治疗VCD诱导的早发性卵巢功能不全的疗效机制。结果:实验一:1.动情周期:对照组小鼠均出现规律的动情周期,有典型的阴道脱落细胞种类和比例的动态变化,动情周期全部正常;而模型组小鼠正常者仅1只。计算正常率,对照组为100%,模型组仅为12.5%,两组间比较有统计学意义(P<0.05)。2.卵巢形态:对照组卵巢内可见各级卵泡存在,并有较大窦状卵泡,卵泡形态典型,卵巢内血管丰富。模型组卵巢体积减小,其内几无各级卵泡,残存较多闭锁卵泡,血供较对照组减少。3.各级卵泡计数:相比对照组,模型组的各级卵泡数均减少(P<0.05),有统计学差异。实验二:1.小鼠脏器指数:VCD造模后小鼠卵巢及子宫的脏器指数相比于对照组均下降(P<0.05),差异有统计学意义;而护阳养坤方、干细胞和干细胞联合护阳养坤方治疗的三组,相比于模型组,脏器指数均升高(P<0.05),差异有统计学意义;其中三种治疗干预措施对卵巢和子宫脏器指数的影响之间无统计学差异。2.动情周期:各组小鼠动情周期的改变有统计学差异(P<0.01),除对照组小鼠动情周期正常率为100%外,各组小鼠动情周期均发生改变,联合治疗组中周期重度失常率最低,正常率最高(5.26%)。3.肝肾组织结构的变化:光镜下观察,各组小鼠肝脏、肾脏组织病理形态正常。4.各级卵泡计数:与对照组相比,模型组小鼠卵巢内各级卵泡数目均减少(P<0.01)有统计学差异;而与模型组相比,护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中除窦状卵泡外,各组卵泡数目都有所增加(P<0.05);原始卵泡数在单纯干细胞组和对照组间有统计学差异(P<0.05);与模型组相比,联合治疗组窦状卵泡数升高(P<0.01)。5.血清性激素水平的变化:与对照组相比,模型组中FSH水平较高(P<0.01),AMH水平下降(P<0.01),有统计学意义;与模型组相比,护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组FSH相对降低(P<0.01),AMH相对升高(P<0.05),有统计学差异;护阳养坤方、干细胞和干细胞联合护阳养坤方治疗组和对照组相比AMH水平均有统计学差异(P<0.05)。各组间小鼠的E2水平均无统计学差异(P>0.05)。实验三:miRNA 的表达:miR143、miR145、miR135、miR429,4 个 microRNA 各组间均无统计学差异(P>0.05)。其中对照组于模型组间无统计学差异且治疗干预各组间相较对照组均差异微小。2.小鼠卵巢蛋白的免疫组织化学表达:与对照组相比,模型组中免疫相关炎症因子TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.01)均升高,与模型组相比干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中TNF-α相对较低(P<0.05),护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中IL-6相对较低(P<0.01),有统计学差异。与对照组相比,模型组中FSHR(P<0.05)和PR(P<0.01)的表达降低;与模型组相比,干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中FSHR相对较高(P<0.01),护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中PR相对较高(P<0.05),有统计学差异。各组间ER的表达无统计学差异(P>0.05)。与对照组相比,模型组中 TGF-β、BMP4、TAK1、JNK(P<0.01)和 Smad4(P<0.05)蛋白的表达明显升高;与模型组相比,护阳养坤方组和干细胞联合护阳养坤方组中TGF-β表达相对较低(P<0.05),而干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中BMP4表达相对较低(P<0.05),有统计学差异,Smad4(P<0.05)和TAK1(P<0.01)仅干细胞联合护阳养坤方组中表达相对降低。3.小鼠蛋白表达:TGF-β:与对照组相比,模型组中TGF-β蛋白的表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,护阳养坤方组、干细胞组和干细胞联合护阳养坤方组中TGF-β表达相对较低(P<0.05)。Smad4:与对照组相比,模型组中Smad4蛋白的表达升高(P<0.05);与模型组相比,3个治疗组中Smad4表达量均降低(P<0.05);而护阳养坤方组和干细胞组的Smad4表达量与对照组之间有差异(P<0.01)。FSHR:与对照组相比,模型组中FSHR的表达降低(P<0.05);与模型组相比,3个治疗组中FSHR的表达量均升高(P<0.01)。6.小鼠各组mRNA相对表达量:与对照组相比,模型组中TAK1、TRAF6、TAB1、TAB2、Smad4、Smad2、Smad3、MKK6、P38 和 JNK 的 mRNA 表达均升高(P<0.05),而在不同治疗组中,以上基因存在不同程度的下降。结论:1.VCD以160 mg·kg-1的剂量连续15天腹腔注射的方法造模可行,成功建立了 VCD诱导的早发性卵巢功能不全C57B/L6小鼠模型;2.护阳养坤方、胚胎干细胞移植、干细胞联合护阳养坤方治疗可提高POI小鼠的血清AMH水平并降低FSH水平,增加卵泡个数,并对卵巢功能有修复效果;3.护阳养坤方对胚胎干细胞移植治疗POI的促进作用是通过TGF-β-TAK1通路实现的。更多还原

关 键 词： 护阳养坤方 [2874348]胚胎干细胞 早发性卵巢功能不全

分 类 号： [R271]

领　　域： []