导　　师： 林春水

学科专业： J0217

授予学位： 博士

作　　者： ;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 研究背景及目的慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以气道、肺组织为损伤部位,以持续性气流受限为特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿,可进展为肺源性心脏病和呼吸衰竭的常见慢性肺部疾病,与气道和肺组织对有毒气体或有害颗粒产生异常炎性反应有关,具有较高发病率、致残率和致死率,造成严重社会经济负担。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一种新型高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,是临床常用麻醉辅助药物。越来越多临床研究表明,右美托咪定可通过抑制细胞凋亡、减轻炎症反应和细胞氧化应激反应等机制对大脑、心脏、肾脏、肝脏及肺脏等多种器官起保护作用,其中,尤以肺脏保护作用最为明显。miRNA-146a是近年来研究热点,其可靶定TLR4/依赖MyD88途径重要组成部分TNF受体相关因子6(TRAF6)和白细胞介素1受体相关激酶1(IRAK1),激活TLR4下游信号分子NF-κB,诱导大量炎症因子,如IL-6、IL-1β、TNF-α等表达释放,促进炎症反应级联放大,参与COPD炎症相关发病过程,可能是COPD治疗新靶点。由此,我们提出假设,右美托咪定可调控miRNA-146a对COPD肺损伤起到保护作用,其明确机制尚不清楚,是本课题研究重点,也是创新之处。本研究拟建立COPD大鼠模型,明确COPD大鼠肺损伤的病理基础;阐明右美托咪定调控miRNA-146a对COPD肺损伤的保护作用及机制。第一部分COPD大鼠动物模型的建立及肺功能检测与组织学检查目的建立COPD肺损伤大鼠动物模型,通过观察大鼠一般状况、肺功能检测、动脉血气分析、支气管肺泡灌洗液检测以及肺组织病理学检查,明确COPD肺损伤的病理基础。方法选取16只SD大鼠并随机分为2组,空白对照组(8只)和COPD组(8只),利用烟雾熏吸法建立大鼠COPD肺损伤模型,检测肺功能指标如潮气量(Tidal volume,TV)、最大呼气流量(Peak expiratory flow,PEF)、50%肺活量最大呼气流量(EF 50)、0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)和FEV0.3与用力肺活量(FVC)比值(FEV0.3/FVC);分析大鼠动脉血氧分压(Pa02)和二氧化碳分压(PaC02);收取大鼠支气管肺泡灌洗液,并进行细胞计数、分类及蛋白质含量检测;取大鼠肺组织,行湿/干重比检测和组织病理学检查。结果1.一般状况:空白对照组大鼠实验过程中饮食、饮水正常,体重增长正常,毛发光滑,无明显呼吸道症状;COPD组大鼠逐渐出现厌食、体重减轻、毛发暗黄脱落、活动减少,并出现喷嚏、喘息以及呼吸频率增快等呼吸道症状。2.肺功能检测:空白对照组大鼠TV为2.65±0.21 mL,PEF为38.55±0.24 mL/s,EF50 为 1.81±0.06 mL/s,FEV0.3 为 4.44±0.26 mL,而 FEV0.3/FVC 为 88.45±0.34%;COPD 组大鼠 TV 为 1.26±0.17 mL,PEF 为 17.61±0.35 mL/s,EF50 为 1.20±0.14 mL/s,FEV0.3 为 2.52±0.28 mL,FEV0.3/FVC 为 63.39±0.22%。COPD 组大鼠TV、PEF、EF 50、FEV0.3和FEV0.3/FVC均显著低于空白对照组大鼠(<0.05)。3.动脉血气分析:空白对照组大鼠动脉血Pa02为89.35±4.30 mmHg,而COPD组动脉血Pa02为73.12±5.11 mmHg,COPD组大鼠动脉血Pa02显著低于空白对照组大鼠动脉血Pa02(p<0.05)。空白对照组大鼠动脉血PaCO2为43.22±5.19 mmHg,而 COPD 组动脉血 PaCO2 为 56.36±6.71 mmHg,COPD 组大鼠动脉血PaC02显著高于空白对照组大鼠动脉血PaC02(p<0.05)。4.支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及蛋白浓度检测:相比于空白对照组,COPD组大鼠BALF白细胞总数显著增加(2.33±1.19×1 08/L vs.1.45±0.41 × 108/L,p<0.05),且中性粒细胞比例显著增高(17.4±7.2%vs.8.6±3.4%,p<0.05),单核巨噬细胞比例显著减低(73.3±2.6%vs.83.4±1.1%,p<0.05),淋巴细胞比例无显著性差异(8.1±2.0%vs.7.8±2.7%,p>0.05)。空白对照组大鼠BALF蛋白含量为193.19±33.21 mg/L,COPD组大鼠BALF蛋白含量为363.93±41.38 mg/L,COPD组大鼠BALF蛋白含量显著高于空白对照组大鼠BALF 蛋白含量(p<0.05)。5.大鼠肺脏湿/干重比(W/D):空白对照组大鼠肺脏整体观呈粉红色,W/D为4.02±0.39,而COPD组大鼠肺脏整体观色泽苍白,肺表面可见大小不等肺大疱,W/D为5.41±1.03,COPD组大鼠肺脏W/D显著高于空白对照组大鼠肺脏W/D(p<0.05)。6.肺组织病理学变化:空白对照组肺组织切片镜下可见支气管上皮纤毛丰富、排列整齐、未见脱落,支气管管壁规整、未见增厚及炎性细胞浸润,管腔内未见炎性渗出物,肺泡腔结构完整、未见明显病理性扩大。COPD组肺组织切片镜下可见支气管纤毛柱状上皮呈锯齿样增生增厚,纤毛脱落倒伏,粘膜下腺体增生肥大,炎性细胞广泛浸润,杯状细胞增生,支气管管腔内粘液蓄积,管壁结缔组织增生,平滑肌增厚,可见单核细胞和淋巴细胞浸润,肺泡大小不等、结构紊乱,肺泡壁变薄、断裂,肺泡腔扩大,部分融合成较大的囊腔。结论烟雾熏吸法可有效建立COPD肺损伤大鼠模型,可明确典型COPD肺损伤的病理基础。第二部分右美托咪定降低miRNA-146a表达抑制COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡目的研究右美托咪定对具有介导COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡作用的miRNA-146a表达的影响,利用流式细胞仪、实时定量PCR检测miRNA-146a以及凋亡相关因子p53和Bcl-2表达水平改变,以期明确右美托咪定对COPD肺损伤的保护机制。方法选取24只SD大鼠并随机分为3组:空白对照组(8只)、COPD未给药组(8只)和COPD右美托咪定给药组(8只)。分离、纯化、培养各组大鼠肺泡上皮细胞。空白对照组肺泡上皮细胞取自正常大鼠肺组织,COPD未给药组和COPD右美托咪定给药组肺泡上皮细胞取自COPD大鼠模型肺组织,COPD右美托咪定给药组加入5 μM右美托咪定培养3天,空白对照组和COPD未给药组将给予等量生理盐水培养3天,进行细胞凋亡检测和实时定量PCR检测,明确细胞凋亡情况和miRNA-146a以及凋亡相关因子p53和Bcl-2的表达水平。结果1.肺泡上皮细胞凋亡流式细胞仪检测结果显示:COPD未给药组和COPD右美托咪定给药组损伤细胞比例、坏死细胞比例和凋亡细胞比例均较正常对照组显著升高(p<0.05),而正常存活细胞比例显著降低(p<0.05);COPD右美托咪定给药组损伤细胞比例和凋亡细胞比例较COPD未给药组显著降低(p<0.05),正常存活细胞比例则显著增高(p<0.05)。COPD右美托咪定给药组肺泡上皮细胞凋亡率较COPD未给药组显著降低(11.15±0.51vs30.19±1.61%,p<0.05)。2.右美托咪定抑制miRNA-146a基因表达情况实时定量PCR检测结果显示:COPD未给药组和COPD右美托咪定给药组miRNA-146a表达明显高于空白对照组(p<0.05),但COPD右美托咪定给药组miRNA-146a表达明显低于COPD未给药组(p<0.05)。3.右美托咪定抑制p53基因表达情况实时定量PCR检测结果显示:COPD未给药组和COPD右美托咪定给药组p53表达明显高于空白对照组(p<0.05),但COPD右美托咪定给药组p53表达明显低于COPD未给药组(p<0.05)。4.右美托咪定抑制Bcl-2基因表达情况实时定量PCR检测结果显示:COPD未给药组和COPD右美托咪定给药组Bcl-2表达明显高于空白对照组(p<0.05),但COPD右美托咪定给药组Bcl-2表达明显低于COPD未给药组(p<0.05)。结论miRNA-146a通过p53和Bcl-2介导肺泡上皮细胞凋亡,右美托咪定可降低miRNA-146a表达抑制COPD大鼠肺泡上皮细胞凋亡从而有效保护肺组织。更多还原

关 键 词： 右美托咪定 [8301818]COPD [6729836]肺损伤 [4085951]细胞凋亡 miRNA-146a

分 类 号： [R614]

领　　域： []