导　　师： 崔堂兵;李健雄

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 蜡样芽胞杆菌CZ(Bacillus cereus CZ)是本实验室自筛野生菌,可以产生高活性的胞外L-亮氨酸氨肽酶。在实验室之前的发酵优化中发现碳源对该氨肽酶的产生具有明显的影响,其他因素则影响很小。由于ccpA基因是低GC含量的革兰氏阳性菌中负责中心碳代谢的全局调控因子,所以该课题拟研究在CcpA与氨肽酶之间是否存在某种联系,并尝试提高氨肽酶产量。利用温敏型质粒pKSV7对B.cereus CZ进行无痕敲除,得到ccpA基因缺陷菌株CZ△ccpA,并构建基因回补株CZ1对敲除菌株表型进行验证。三株菌在LB培养基中的生长代谢基本无差异,表明ccpA缺失不影响菌株的生长活力。使用摇瓶进行发酵,发现ccpA缺失可以一定程度上解除高浓度氮源对菌株生物量的抑制;以D-木糖、L-阿拉伯糖等非PTS碳源进行发酵时,CZ△ccpA的氨肽酶活高于CZ及CZ1,尤其以D-木糖发酵时氨肽酶酶活比野生株CZ高48.25%。优化了氨肽酶的发酵条件:当以4%(W/V)D-木糖为单一碳源、1.5%尿素为氮源,发酵84 h时,缺失突变株酶活最高可达337.24U·m L。实验发现利用柠檬酸钠发酵时CZ△ccpA的pH与CZ、CZ1产生较大差距,以甘露低聚糖为碳源时CZ、CZ1迅速死亡而CZ△ccpA则可以正常生长;本人针对这些结果进行了进一步实验探究。利用荧光定量PCR分析发现:B.cereus CZ ccpA基因缺失可以降低糖酵解,提高TCA循环的表达通量,使碳源得到更为有效地利用。此外,使用PTS碳源发酵时,CZ△ccp A产酶低于CZ与CZ1,而使用非PTS碳源发酵时结果刚好相反,这可能与gltAB操纵子对谷氨酸合成酶的调控有关。论文对氨肽酶产生的调控机制进行了合理推测,但由于时间关系未能进行确切的验证。

关 键 词： 蜡样芽胞杆菌 分解代谢物控制蛋白 基因敲除 亮氨酸氨肽酶 荧光定量

领　　域： []