导　　师： 戴仁科

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 华南理工大学

摘　　要： 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是严重的全球性公共卫生问题之一。干扰素和核苷类似物为目前临床常用的抗乙肝药物,在一定程度上能有效降低患者血清中的病毒数量,但易引起病毒耐药性突变,且难以彻底清除宿主细胞内HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。而新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可以对许多物种基因组进行DNA的精确编辑,这一高效、快捷的技术使得从根本上清除cccDNA成为了可能。本研究针对HBV基因组设计并构建特异性CRISPR/Cas9系统,在体外乙肝细胞模型HepG2.2.15中研究CRISPR/Cas9系统对HBV DNA复制和抗原表达影响。同时应用全基因组测序技术分析CRISPR/Cas9系统剪切cccDNA后对诱导病毒DNA整合的风险。研究首先针对HBV基因组设计并筛选靶序列,分别构建HBV特异性sgNRA重组表达载体U6-X3sgRNA和U6-17sgRNA。载体经测序鉴定后,与hCas9质粒共转染HepG2.2.15细胞,转染48h后分别应用电化学发光免疫分析法和荧光定量PCR方法检测细胞上清中的乙肝表面抗原和HBV DNA含量,与空白对照组进行统计学比较分析。同时,为了研究CRISPR/Cas9系统剪切cccDNA后对诱导病毒整合的风险,首先模拟其切割过程,设计绿色荧光蛋白(green fluoresence protein,GFP)/sgRNA报告系统进行整合风险研究:分别将环状对照组(pCircular GFP+phCas9+psgRNA-control)、线性对照组(pLinear GFP+phCas9+psgRNA-control)及环状实验组(pCircular GFP+phCas9+psgRNA-GFP)质粒转染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选后,应用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测不同组别绿色荧光蛋白表达情况。然后将有效抑制病毒复制和表达的CRISPR/Cas9系统转染至HepG2.2.15细胞48h,检测HBV DNA含量和表面抗原滴度,并将转染细胞连续传代培养15天,最后进行全基因组测序和病毒DNA整合的生物信息学分析。结果表明,U6-X3sgRNA介导的CRISPR/Cas9系统处理组病毒的滴度为(2.80±0.

关 键 词： 乙型肝炎病毒 病毒整合

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