导　　师： 李凌;朱利

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 背景和意义：　　载脂蛋白L1是人体内的固有免疫因子，仅在人类和少数哺乳动物体内表达。作为该蛋白家族中唯一可以分泌到血液中的成员，APOL1蛋白是高密度脂蛋白的组成成分，具有溶锥虫作用。2014年，Taylor等阐明细胞内APOL1蛋白具有抗感染作用。细胞内APOL1蛋白可以抑制HIV-1在巨噬细胞内的复制。本课题组前期研究发现，在EV-A71感染引起的手足口病重症患儿血液中APOL1蛋白过高表达。因此本研究通过构建Apol1基因敲除细胞株和过表达细胞株来探究APOL1蛋白对EV-A71在细胞内复制中的作用，不仅有助于理解EV-A71的致病机制，而且可以为EV-A71的重症感染的防治提供新的思路和途径。　　方法：　　(1)针对Apol1基因设计siRNA，敲减HBMEC细胞中APOL1蛋白表达并检测细胞中EV-A71的复制情况。　　(2)利用CRISPR/Cas9技术构建敲除Apol1基因的HBMEC稳定细胞株。　　(3)利用Cumate表达载体构建可诱导稳定表达APOL1的293T细胞株。　　(4)EV-A71分别感染以上构建的两种细胞株，探索APOL1与EV-A71复制的关系。　　结果：　　(1)在HBMEC中，转染Apol1siRNA并感染EV-A7124h后，细胞内病毒含量相对于未敲减的细胞显著提高(F=170.4，p＜0.05)。　　(2)成功构建敲除Apol1的HBMEC细胞，命名为HBMEC-APOL1-KO,同时感染空载病毒的细胞命名为HBMEC-Lenti。　　(3)成功构建可诱导表达APOL1蛋白的293T细胞，命名为293T-APOL1-GFP，同时感染空载的细胞命名为293T-GFP。经real-time PCR和western blot验证，293T-APOL1-GFP细胞表达APOL1的量随着诱导剂浓度的增加而增加，且到50μg/ml和100μg/ml时，APOL1蛋白表达量达到最大(F=537.9，p＜0.01)。CCK-8实验证明诱导剂浓度低于200μg/ml时，细胞生长无影响(F=1.082，p=0.2903)。　　(4)病毒分别感染HBMEC-APOL1-KO和293T-APOL1-GFP细胞株，出现同样的结果，病毒感染12h，细胞内病毒含量比对照组明显�

关 键 词： 肠道病毒 病毒复制 载脂蛋白 蛋白表达

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