导　　师： 刘云岗; 谢晓利

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 南方医科大学

摘　　要： 研究背景多氯联苯(Polychlorinatedbiphenyls,PCBs)是一类持久性有机污染物。因其极难降解,虽然全球各国在20世纪70年代陆续停产PCBs,但至今仍广泛存在于环境中。经长期的毒理学研究证实,多氯联苯可经动物的皮肤、呼吸道和消化道而为机体所吸收。对动物的毒性影响通常表现在肝脏、皮肤、免疫系统、生殖系统等。2013 年国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,IARC)将PCBs归类为人类致癌物。现有研究资料表明,非二噁英类似PCBs可引起肝癌细胞的自噬性细胞死亡,但其对正常细胞的毒性作用还未有深入研究。自噬(autophagy)是细胞依赖溶酶体对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程,其主要作用是清除并降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子等。自噬作用的机制失灵将导致细胞异常甚至死亡。越来越多的证据表明一些疾病,例如神经退行性疾病,肿瘤,感染,器官组织老化和缺血/再灌注等与自噬不足或自噬过度直接相关。根据预实验结果,我们推测,非二噁英类似PCBs对肝脏的毒性作用与其诱导了异常的细胞自噬有关。本研究主要探讨自噬异常在环境中常见的非二噁英类似PCBs(PCB28/PCB52)所致肝细胞毒性中的作用,为防治多氯联苯的环境污染奠定实验基础。目的本研究旨在通过PCB 28/PCB 52暴露后,检测大鼠正常肝细胞(BRL-3A)的细胞活性、自噬体的形成、自噬通路相关基因和蛋白的表达及氧化应激水平,探讨自噬在PCBs所致肝细胞毒性中的作用;此外,自噬通路激动剂/抑制剂使用后,观察上述指标的表达改变,进一步明确PCBs通过引起自噬异常导致肝细胞毒性的发生,为多氯联苯环境污染的防治奠定基础。方法1.通过CCK-8法观察细胞活性和细胞毒性。2.通过透射电镜证实BRL-3A细胞自噬的发生。3.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹实验,研究PCB28/PCB52暴露后,BRL-3A细胞中自噬相关基因及蛋白的表达。4.使用免疫荧光观察细胞内自噬相关蛋白的表达位置及表达量的变化。5.通过氧化应激实验检测发生自噬后的BRL-3A细胞内氧化应激水平。6.PCB 28/PCB 52暴露同时,给予自噬激动剂Rapamycin/抑制剂3-MA后,检测BRL-3A细胞内上述指标的改变,进一步明确自噬异常在PCBs所致肝细胞毒性中的作用。结果1.PCB 28/PCB 52暴露后BRL-3A细胞活性下降。2.PCB 28/PCB 52暴露后BRL-3A细胞内自噬体的数目增多。3.PCB 28/PCB 52暴露后BRL-3A细胞中自噬相关基因和蛋白的表达量上升。4.PCB 28/PCB 52暴露后BRL-3A细胞凋亡率增加。5.PCB 28/PCB 52暴露后BRL-3A细胞氧化应激水平上升,造成氧化损伤。6.3-MA与PCB 28/PCB 52联合处理BRL-3A细胞后其增殖率明显上升,自噬体数量明显减少,自噬相关基因及蛋白表达量明显下降,凋亡率明显下降,氧化应激水平明显降低;Rapamycin与PCB 28/PCB 52联合处理BRL-3A细胞后,上述指标变化情况与3-MA与PCB 28/PCB 52联合处理相反。结论PCB 28/PCB 52对大鼠肝细胞有明显毒性作用,且自噬水平异常是其机制之一。此外,细胞凋亡、氧化应激等因素可能与自噬和细胞毒作用共存,或者可能相互促进(需进一步验证)。更多还原

关 键 词： [3561125]自噬 [513751]多氯联苯 3-甲基腺嘌呤 [5402578]雷帕霉素

分 类 号： [R99]

领　　域： []