导　　师： 蒋建伟;朱孝峰

授予学位： 硕士

作　　者： (）;

机构地区： 暨南大学

摘　　要： 研究目的：　　研究肺癌A549细胞株中PTEN缺失对线粒体功能的影响，并探究PTEN缺失导致线粒体自噬缺陷的分子机制，同时初步探究PTEN缺失介导的线粒体自噬缺陷与细胞迁移的调控关系。　　研究方法：　　利用逆转录病毒载体将目的序列转导到目标细胞中，构建稳转细胞株;利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞株;通过激光共聚焦显微镜观察线粒体形态并判断线粒体自噬是否发生;利用Western blotting检测了线粒体相关膜蛋白及细胞内相关蛋白的表达水平;通过RT-qPCR法检测线粒体mtDNA的数量的变化;通过MTT和克隆形成抑制实验检测细胞增殖;通过细胞划痕和Transwell小室跨膜迁移实验检测肿瘤细胞的迁移。　　研究结果：　　1.PTEN影响肺癌A549中的自噬水平　　构建稳转株并筛选出PTEN低表达的细胞株。在PTEN低表达的细胞株中，线粒体解偶联剂CCCP的诱导下，利用激光共聚焦显微镜可观察到LC3蛋白在细胞中的聚集点情况来初步判断自噬水平的高低。结果发现，在空载细胞株中CCCP处理导致细胞内LC3的点状聚集明显增多，自噬发生。　　2.PTEN低表达导致线粒体自噬缺陷　　PTEN低表达的肺癌细胞株中，在CCCP的刺激下，用免疫荧光的方法观察到线粒体自噬发生障碍，线粒体与溶酶体的共定位减少，损伤的线粒体无法清除;Western blotting检测到相关线粒体膜蛋白（Tom20、Tim23）的表达不变;RT-qPCR法检测到线粒体mtDNA数量减少的明显较对照组慢，线粒体自噬发生障碍。3.PTEN的缺失对肺癌A549细胞增殖、迁移等生物学功能的影响　　利用MTT及克隆形成抑制实验发现PTEN的缺失对肺癌A549细胞增殖没有显著影响;细胞划痕和Transwell小室跨膜迁移实验发现PTEN的缺失对肺癌A549细胞迁移能力显著增强。　　4.PTEN缺失介导的线粒体自噬缺陷促进了细胞迁移　　PTEN缺失介导线粒�

关 键 词： 肺癌 发病机制 抑癌基因 线粒体 自噬缺陷 细胞迁移

领　　域： [] []